Citrate synthase 1 (mitochondrial) and citrate synthase 2 (nonmitochondrial) were purified from Saccharomyces cerevisiae. The physical and enzymatic characteristics of citrate synthase 2 were ananlyzed in comparison with citrate synthase 1. Both isoenzymes were shown to be dimeric proteins of identical subunits, and the molecular weights of the subunits were estimated to be 48.3kDa for citrate synthase 1 and 47.0kDa for citrate synthase 2, respectively. The optimal pH value for enzyme activity was pH 7.5 for both isoenzymes. However, the optimal temperature for the activity was strikingly different; while the activity of citrate synthase 1 reached its peak at 65.deg.C, that of citrate synthase 2 was maximal at 40.deg.C. Citrate synthase 2 showed much lower thermal and pH stability than citrate synthase 1. In addition, citrate synthase 2 was affected much more by the metal ions such as $Zn^{2+}$ , $Mn^{2+ , and $Co^{2+} than citrate synthase 1. Among the several possible regulatory metabolites tested, ATP showed the strongest inhibitory effect on both enzymes. ADP and NADH were found to have greater effect on citrate synthase 2 than on citrate synthase 1. Kinetic analysis revealed that citrate synthase 2 has approximately 7- and 3.5-fold lower affinity to acetyl CoA and to oxaloacetate, respectively, than citrate synthase 1.
제초제(除草除) glyphosate는 EPSP-synthase 생합성(生合成) 자체는 억제(抑制)하지 못하며 단지 효소활성(酵素活成)만을 억제한다. 이러한 억제는 뿌리 빛 줄기 정단부에서 현저했다. EPSP-synthase의 전체구(前體區) 단백질(蛋百質)은 54 kDa의 분자량(分子量)을 갖으며, 엽록체(葉綠體)내 성숙(成熟) 단백질(蛋百質)은 45kDa 정도의 분자량(分子量)을 나타낸다. Glyphosate 처리 직후(直後) 인위적 암처리(暗處理)는 EPSP-synthase의 엽록체(葉綠體)내 삽입을 완전히 억제하지 못한다. 이러한 결과는 Glyphosate에 의한 EPSP-synthase 엽록체(葉綠體)내 삽입 기작은 전적으로 광(光)의존적인 것은 아니며 오히려 광의존적 제초활성을 나타내는 glyphosate의 엽록체내 유입후 아직까지 알려지지 않은 조절기작에 의해 간접적으로 억제되는 것으로 보였다.
5-Enolpyruvylshikimate 3-phosphate(EPSP) synthase는 방향족 아미노산을 생합성하는 shikimate phathway의 6번째 효소로 광범위 제초제인 glyphosate의 target enzyme이다. 본 연구에서는, glyphosate에 저해를 받지 않는 EPSP synthase를 개발하고자 하는 연구의 한 단계로서, 우선, EPSP synthase를 대량 발현시킬수 있는 expression vector인 pET-25b를 사용하여 발현시킨 다음, 발현된 효소가 periplasmic space로 transport되는지 또 발현된 단백질이 효소 활성을 가지고 있는지 확인하고자 하였다. 그 결과, pelB leader를 앞에 붙여 발현시킨 EPSP synthase는 periplasmic space로 제대로 transport되며, 단백질 생산 및 periplasmic space로의 수송은 induction 온도에 의해 크게 좌우된다는 것을 관찰하였다. Periplasmic space로 수송되는 EPSP synthase의 양은 $34^{\circ}C$에서 induction시켰을 때 가장 많은 것으로 나타났다. 한편, pET-25b를 이용하여 발현시킨 EPSP synthase는 C-terminal 부위에 HSV-tag, His-tag등 26개 아미노산이 더 있는 상태로 만들어지는데, His-tag은 $Ni^{2+}$-affinity chromatography를 통한 정제에, HSV-tag은 Western blotting을 통한 detection에 각각 이용할 수 있다. 또한, 이와 같이 발현된 recombinant EPSP synthase는 phosphocellulose resin에 결합하였다가 기질인 shikimate 3-phosphate와 phosphoenolpyruvate에 의해 elution되며, glyphosate에 의해 저해되는등 wildtype효소와 같은 효소 특성을 보였다.
The 3-Deoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase is the first enzyme of aromatic amino acid-, folic acid-, and phenazine-1-carboxylic acid biosynthetic pathways. DAHP synthase of Bacillus sp. B-6 that produces phenazine-1-carboxylic acid was feedback inhibited by two intermediary metabolites of aromatic amino acid biosynthetic pathways, prephenate and chorismate, but not by other metabolites, such as anthranilic acid, shikimic acid, p-aminobenzoic acid, and 3-hydroxyanthranilic acid. DAHP synthase of Bacillus sp. B-6 was not inhibited by end products, such as aromatic amino acids, folic acid, and phenazine-1-carboxylic acid. The inhibition of DAHP synthase by prephenate and chorismate was non-competitive with respect to erythrose 4-phosphate and phosphoenolpyruvate. Prephenate and chorismate inhibited 50% of the DAHP synthase activity at concentrations of $2{\times}10^{-5}\;M$ and $1.2{\times}10^{-4}\;M$, respectively The synthesis of DAHP synthase of Bacillus sp. B-6 was not repressed by exogenous aromatic amino acids, folic acid, and phenazine 1-carboxylic acid, single or in combinations.
Chitin is an important structural component of fungal cell wall and is synthesized by chitin synthase I, II, and III. The chitin synthase II is an essential enzyme for the formation of primary septum in Saccharomyces cerevisiae. Therefore, specific inhibitors of this enzyme might block the formation of fungal cell wall and could be used as effective antifungal agents. To search chitin synthase IIinhibitors from natural products, 67 plants were extracted with methanol and examined for the inhibitory activities against chitin synthase II of S. cerevisiae by our cell free assay system. As a result, the extracts from 16 plants showed more than 70% inhibition at the concentration of $280{\;}\mu\textrm{g}/ml$. Of note, Laurus nobilis (81.4%), Lonicera maackii (81.5%), Berchemia berchemiaefolia (82.9%), Koelreuteria paniculata (87.9%), Chamaecyparis pisifera (86%) and Taxus cuspidata (83.9%) inhibited strogly the chitin synthase IIactivity.
Glyphosate (N-[phosphonomethyl]glycine)를 토마토(Lycopersicon esculentum Mil)의 동화부위(同化部位)에 부분처리(部分處理)하거나 전(全) 식물체(植物體)에 분무처리(噴霧處理)하였을 때 EPSP-synthase의 활성(活性) 감소(減少)가 나타났다. EPSP-synthase의 활성(活性)은 처리된 식물체(植物體)의 엽록소(葉綠素)의 감소보다 시기적으로 먼저 나타나는 현상이었다. EPSP-synthase의 활성(活性)은 glyphosate처리(處理)에 민감한 효소(酵素)로서 토마토의 세포현탁배양조직(細胞顯濁培養組織)과 분열조직(分裂組織)간에는 활성(活性)의 차이가 없없다. EPSP-synthase의 활성은 4-6 nkat/mg protein 정도이었다. EPSP-synthase의 활성(活性)억제는 glyphosate 처리(處理) 36시간 후 부터 나타나기 시작하였고, 엽록소(葉綠素)의 감소는 처리 48 시간 후 부터 나타나기 시작하였다. 세포현탁배양(細胞顯濁培養)에서 치사농도(致死濃度) 이하(以下)에서 glyphosate는 생체중(生體重)을 저하(低下)시켰으며 생육단계(生育段階) 중 lag-phase를 연장(延長)시켜 생육(生育)이 더디도록 하였다. Glyphosate 존재(存在)하에서 생체중(生體重)은 계대(繼代)배양 후 14일이 지난 뒤에 생체중(生體重)이 최고(最高)에 달하였다. EPSP-synthase에 대한 gly-phosate의 억제(抑制)효과는 lag-phase에서 심하게 나타났다.
NO의 위산분비에 대한 작용을 규명하기 위하여 분리한 토끼위선세포에서 hypoxia/reoxygenation과 acidosis후 위산분비와 NO synthase 활성을 측정하였다. 분리한 위선세포에 30분의 hypoxia와 1시간의 reoxygenation을 주었으며, acidosis를 위하여 배지의 pH를 6.0과 4.0으로 변화시켜 실험하였다. 위산분비는 위선세포 내와 외의 $[^{14}C]-aminopyrine$ 축적비율로 측정하였으며, NO synthase 활성은 NO의 전구물질인 $[^{14}C]L-arginine$으로부터 $[^{14}C]-citrulline$으로의 전환율로 결정하였다. 결과로서 dibutyryl cAMP는 농도 의존적으로 위산분비를 촉진시켰으나 NO synthase 활성엔 영향을 주지 않았다. Hypoxia/reoxygenation은 기초 및 자극 위산분비를 억제하였으며 acidosis에 의해 위산분비억제는 더욱 심화되었다. Constitutive NO synthase 활성 역시 hypoxia/reoxygenation과 acidosis에 의해 억제되었다. 결론적으로 hypoxia/reoxygenation과 acidosis 같은 위점막의 병적상태는 위산분비와 NO 유리를 모두 억제하나, 기초상태의 위선에서 dibutyryl cAMP에 의한 위산분비 촉진에 대한 NO의 직접적인 작용은 확인되지 않았다.
Assay conditions for screening of $\beta$-1,3-glucan synthase inhibitor were evaluated. Cells in the beginning of mid-log phase showed the highest activity of the $\beta$-1,3-glucan synthase. Cells permeabilized with 1% digitonin treatment could be used as a good crude enzyme source for convenient screening of the $\beta$-1,3-glucan synthase inhibitors. Calcofluor white (0.125% in final) and papulacandin B (25 $\mu$g/ml) inhibit 90% and more than 50% of the $\beta$-1,3-glucan synthase activity, respectively. Cells grown at 37$\circ$C showed higher enzyme activity than those of 25$\circ$C. Catalytic factor of the $\beta$-1,3-glucan synthase was solubilized from particulated membrane preparations, holoenzyme, by extracting with 0.00938% CHAPS.
We identified a 1,134-bp putative type III polyketide synthase from the sequence analysis of Streptomyces peucetius ATCC 27952, named Sp-RppA, which is characterized as 1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene synthase and shares 33% identity with SCO1206 from S. coelicolor A3(2) and 32% identity with RppA from S. griseus. The 1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene synthase is known to catalyze the sequential decarboxylative condensation, intramolecular cyclization, and aromatization of an oligoketide derived from five units of malonyl-CoA to give 1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene, which spontaneously oxidizes to form 2,5,7-trihydroxy-1,4-naphthoquinone (flaviolin). In this study, we report the in vivo expression and in vitro synthesis of flaviolin from purified gene product (Sp-RppA).
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[게시일 2004년 10월 1일]
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