• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제25권2호
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• pp.206-216
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• 2015

To clarify the role of surface protective antigen A (SpaA) in the pathogenesis of Erysipelothrix rhusiopathiae C43065 (serotype 2), the spaA deletion mutant of E. rhusiopathiae ${\Delta}spaA$ was constructed by homologous recombination. The virulence of the ${\Delta}spaA$ mutant decreased more than 76-fold compared with that of the wild-type strain C43065 in mice. The mutant strain was sensitive to the bactericidal action of swine serum, whereas the wild-type strain was resistant. The adhesion of wild-type strain to MEF cells was inhibited significantly by treatment with rabbit antiserum against recombinant SpaA (rSpaA) as compared with the treatment with normal rabbit serum, but the mutant strain was not affected. The mutant strain was readily taken up by mouse peritoneal macrophages in the normal rabbit serum, whereas the wild-type strain was resistant. Whereas the rabbit antiserum against rSpaA promoted the phagocytosis of wild-type strain by macrophages, the mutant strain was not affected. In addition, mice vaccinated with the formalin-killed mutant strain were provided 40% protection against challenge by the homologous virulent strain as compared with those with wild-type strain, NaOH-extracted antigen, or rSpaA, which provided more than 80% protection against the same infection. These suggested that SpaA has an important role in the pathogenesis of E. rhusiopathiae infection and could be a target for vaccination against swine erysipelas.

• 미생물학회지
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• 제37권1호
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• pp.49-55
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• 2001

탄저(anthrax)는 그람양성이고 포자형성 세균인 탄저균(Bacillus anthracis)으로부터 발명되어진다. 탄저독소는 세가지 요소로 구성되어 있으며, 방어항원(PA)은 숙주세포 표면에서 탄저 독소단백질 및 이종단백질을 세포질 내로 이동시키는 역할을 한다. 본 연구에서는 PA의 분자적 다양성과 국내에서 탄저균의 진화를 이해하고 확인하기 위해 국내외에서 발견된 탄저균 4 균주와 기존에 보고된 탄저균 26 균주로부터 2,294 bp의 PA유전자(pagA)의 DNA 염기서열을 분식하였다. 탄저균 30 균주으로부터 PA유전자의 염기서열을 비교 분식한 결과, 8개 부위에서 돌연변이를 확인 하였다. 돌연변이가 일어난 부위에 따라서 탄저균을 10종류의 PA 유전자형과 4 종류의 PA 표현형으로 구분하였다. 한국 경주에서 분류된 B. anthracis BAK는 600번째 아미노산 alanine이 valine으로 바뀌어서 B. anthracis ATCC 14185 보다 LF와 PA의 결합 위치를 근접하게 하였다. 탄저균의 Pag의 염기서열을 통한 계통분석학적인 분석 결과는 염색체상에서의 분류와 일치하여 탄저균사이에서 pXO1 플라스미드의 수평적인 이동은 없는 것으로 사료된다.

• 약학회지
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• 제48권6호
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• pp.369-373
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• 2004

We previously reported that Streptococcus pneumoniae capsule attached to the surface protein (JY-Pol) was protective to systemic pneumococcal infection. The JY -Pol antigen induced IgM, IgG, and IgA in mice and provoked cell-mediated immunity. In this current study, we investigated the effect of anti JY-Pol antiserun and monoclonal antibody C2 (Mab C2) specific for the JY-Pol antigen against the pneumococcal disease. Mice that were given the antiserum survived longer than mice that received antiserum pre-absorbed with S.pneumoniae cells or DPBS as a negative control. Heat-treated anti JY-Pol antiserum resulted in survival rates similar to intact fresh JY-Pol antiserum. Mab C2 isolated from JY-Pol-immunized mice also enhanced resistance of naive mice against the pneumococcal diseaser. This protection by Mab C2 appeared to be mediated by opsonization as determined in a RAW 264.7 monocyte/macrophage cell line. Epitope analysis showed that Mab C2 epitope consisted of glucuronic acid and glucose that blocked the interaction of JY-Pol to the C2. Taken together, these data indicate that the antiserum induced by the JY-Pol, a naturally pneumococcal conjugate formula, mediated the protection by passive transfer, which was confirmed by protective effect of Mab C2.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제35권1호
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• pp.55-62
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• 1997

톡소포자충(ToxopLasmn gondii)은 다양한 항원을 가지고 있으며, 이들 항원의 분석은 세 포매개성 면역반응 및 톡소포자충증의 면역학적 진단방법의 연구에 매우 중요하다 본 연구는 톡소포자충의 여러 단백질중 대부분의 충주(strain)에 존재하는 분자량 30 kDa의 단백질을 단클론 항체를 이용하여 분리한 후. 30 kDa 항원의 면역학적 특성을 초음파 추출 조항원과 비교 평가하였다. 톡소포자충의 세포막 항원으로 면역한 마우스 비장세포와 마우스 Sp2/0-Agl4 골수종세포를 융합하여 8개의 단클론 항체를 Western blot으로 확인하였다 이들 단클론 항체는 높은 특이성을 보였으며, $IgG_{2b}가{\;}5개,{\;}IgG^{1}이{\;}2개,{\;}IgG_{2a}$가 1개였다. 간접형광항체법으로 충체내 위치를 관찰한 결과. 30 kDa 항원은 tachyzoite의 표면 세포막에 주로 분포하였다. 단클론 항체와 CNBr-activated Sepharose 4B를 coupling하여 만든 immunoafrnity chromatography를 이용 하여 30 kDa 항원을 분리하였다. 분리한 30 kDa 항원으로 자극시킨 마우스 복강대식세포의 $NO_2^{-}$ 생산량은 초음파 추출 조항원 사용군에 비해 유의하게 증가하였으나 대식세포의 탐식능은 유의한 차이가 없었다. 또한 ELISA로 톡소포자충증을 진단시, 톡소포자충 30 kDa 항원 사용군은 조항원 사용군에 비해 민감도의 변화는 없었으나 특이성은 증가하였다 이상으로 보아 톡소포자충 30 kDa 항원은 감염 방어 면역 효과가 있었으며 진단에 이용시 특이성을 더 높일 수 있었다.

• IMMUNE NETWORK
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• 제2권1호
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• pp.41-48
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• 2002

Background: Viral antigens presented on the cell surface in association with MHC class I molecules are recognized by CD8+ T cells. MHC restricted peptides are important in eliciting cellular immune responses. As peptide antigens have a weak immunigenicity, pH-sensitive liposomes were used for peptide delivery to induce effective cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses. In the previous study, as the HBx peptides could induce specific CTLs in vitro, we tested whether the HLA-A2/$K^b$ transgenic mice that were immunized by HBx-derived peptides could be protected from a viral challenge. Methods: HBx-peptides encapsulated by pH-sensitive liposomes were prepared. $A2K^b$ transgenic mice were immunized i.m. on days one and seven with the indicated concentrations of liposome-encapsulated peptides. Three weeks later, mice were infected with $1{\times}10^7pfu$/head of recombinant vaccinia virus (rVV)-HBx via i.p. administration. The ovaries were extracted from the mice, and the presence of rVV-HBx in the ovaries was analyzed using human TK-143B cells. IFN-${\gamma}$ secretion by these cells was directly assessed using a peptide-pulsed target cell stimulation assay with either peptide-pulsed antigen presenting cells (APCs), concanavalin A ($2{\mu}g/ml$), or a vehicle. To generate peptide-specific CTLs, splenocytes obtained from the immunized mice were stimulated with $20{\mu}g/ml$ of each peptide and restimulated with peptide-pulsed APC four times. The cytotoxic activity of the CTLs was assessed by standard $^{51}Cr$-release assay and intracellular IFN-${\gamma}$ assay. Results: Immunization of these peptides as a mixture in pH-sensitive liposomes to transgenic mice induced a good protective effect from a viral challenge by inducing the peptide-specific CD8+ T cells. Mice immunized with $50{\mu}g/head$ were much better protected against viral challenge compared to those immunized with $5{\mu}g$/head, whereas the mice immunized with empty liposomes were not protected at all. After in vitro CTL culture by peptide stimulation, however, specific cytotoxicity was much higher in the CTLs from mice immunized with $5{\mu}g/head$ than $50{\mu}g/head$ group. Increase of the number of cells that intracellular IFN-${\gamma}$ secreting cell among CD8+ T cells showed similar result. Conclusion: Mice immunized with XEPs within pH-sensitive liposome were protected against viral challenge. The protective effect depended on the amount of antigen used during immunization. XEP-3-specific CTLs could be induced by peptide stimulation in vitro from splenocytes obtained from immunized mice. The cytotoxic effect of CTLs was measured by $^{51}Cr$-release assay and the percentage of accumulated intracellular IFN-${\gamma}$ secreting cells after in vitro restimulation was measured by flow cytometric analysis. The result of $^{51}Cr$-release cytotoxicity test was well correlated with that of the flow cytometric analysis. Viral protection was effective in immunized group of $50{\mu}g/head$, while in the in vitro restimulation, it showed more spectific response in $5{\mu}g$/head group.

• 미생물학회지
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• 제38권1호
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• pp.38-44
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• 2002

국내 분리 침습성 균주중선별된 S. pneumoniae KNIH1156 (type 19F)으로부터 페렴구균의 병원성 인자이며 항원학적으로 다양한 표면단백항원인 pneumococcal surface protein A (PspA)를 분리${\cdot}$정제하였다. 폐렴구균을 CDM-ET배지에서 배양하게 되면 배지내로 PspA가 방출된다는 점과 PspA가 인간의 lactoferrin에 특이적으로 결합한다는 사실을 이용하여 CDM-ET 배지에서 S. pneumoniae KNIH1156 을 배양한 후 배양액을 농축하여 lactoferrinaffinity chromatography에 통과시켜 PspA를 분리, 정제하였다. 정제 후 anti-PspA antiserum으로 PspA를 확인하여 순수분리, 정제되었음을 확인하였으며 또한 인간의 lactoferrin과의 결합능력을 유지하고 있음을 확인하였다. 순수하게 분리하여 정제된 PspA의 면역원성을 확인하기 위하여 ICR mice에 욕강주사하였을 때 $LD_{50}$ 가 $1{\times}10^{7.5}$ CFU/ml께서 $1{\times}10^{10}$ CFU/ml로 약 500배 중가함을 관찰하였다. 따라서 본 실험에서S. pneumoniae KNIH1156 으로부터 분리${\cdot}$ 정제한 PspA가 면역원성과 방어능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

• 미생물학회지
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• 제42권3호
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• pp.195-198
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• 2006

Anthrax lethal toxin은 탄저병의 치사원인이 되는 독소이며, Lethal toxin은 두 종류의 단백질 PA (Protective antigen)과 LF (lethal factor)로 구성되어 진다. PA는 세포표면의 수용체와 결합하여 LF를 세포질 안으로 이동시켜 주는 역할을 한다. LF는 금속 이온$(Zn^{2+})$ 의존적 단백질 가수분해 효소로써 MKKs[MAPK (mitogen-activated protein kinase) kinases] 집단 단백질의 아미노 말단 부분을 절단하여 대상 세포를 죽음으로 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 LF에 대한 특성 분석 및 억제제 개발에 과한 연구를 위해 cell-based high-throughtput screens 개발에 선행되어야 하는 기초 자료를 마련하는데 그 목적이 있다. 이를 위하여 LF의 절단 대상이 되는 기질이 MEK1을 yeast내에서 동시 발현시켜 LF의 활성을 검증하였다. 먼저 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 숙주로 하여 LF의 기질인 MEK1 발현 vector를 구축하였고, 구축된 발현 system을 기본을 LF 활성을 검증하고자 yeast에 형질전환하여 plasmid의 안전성 및 MEK1 유전자의 발현 및 LF에 의한 MEK1 아미노말단의 절단 부위를 확인하였다. 본 연구는 세포내 검증 system 도입의 기초적 자료를 제공하였으며, yeast내의 MEK1 발현은 탄저병의 저해제 선별 및 활성 측정 검증을 생체에서 고효율적이며, 안정적으로 할 수 있다는 가능성을 나타냈다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제38권2호
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• pp.107-110
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• 2000

We investigated the role of recombinant Toxoplasma gondii heat shock protein (rT.g.HSP) 70-full length, rT.g. HSP70-NH2-terminal region, or rT.g. HSP70-carboxy-terminal region in prophylactic immunity in C57BL/6 mice perorally infected with Fukaya cysts of T. gondii. At 3, 4, 5, and 6 weeks after infection, the number of T gondii in the brain tissue of each mouse was measured by quantitative competitive-polymerase chain reaction (QC-PCR) targeting the surface antigen (SAG) 1 gene. Immunization with rT.g.HSP70-full length or rT.g.HSP70-carboxy-terminal region increased the number of T. gondii in the brain tissue after T. gondii infection, whereas immunization with rT.g.HSP70-NHa-terminal region did not. These results suggest that T.g. HSP70-carboxy-terminal region as well as T.g.HSP70-full length may induce deleterious effects on the protective immunity of mice infected with a cyst-forming T. gondii strain, Fukaya.

• 생명과학회지
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• 제16권6호
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• pp.904-910
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• 2006

수지상세포는 종양면역에서 필수적인 강력한 CTL 반응을 개시할 수 있는 유일한 세포이다 . 특히 외인성 종양항원에 대한 CTL 반응 유도는 활성화된 수지상세포의 IL-12 분비를 통한 CD4+ helper T세포의 cross-priming을 필요로 한다. 그러나 최근에 활성화된 수지상세포는 $Th_1$ 면역반응을 유도하지만 활성화 시간이 경과함에 따라 오히려 $Th_2$반응을 유도 할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 OVA를 종양항원 모델로 설정하여 종양특이적인 CTL 반응을 형성하기 위한 최적의 수지상세포 활성화 조건을 조사하였다. 마우스 골수세포에 서 수지상세포로의 분화는 항원제시 기능을 위한 표면분자의 발현 측면에서 볼 때 배양 6일-7일 정도가 적합하였다. 수지상세포의 IL-12 생성능은 배양 6일 이상, OVA 항원 탑재 8시간 이상의 경우에 연이은 LPS 성숙자극으로 오히려 감소하는 경향을 보였다. 즉 배양 6일의 수지상세포에 OVA 항원 탑재를 8시간 수행한 경우(8-h DC)가 in vitro에서의 IL-12생성능, ex vivo에서의 세포내 $IFN-{\gamma}$를 발현하는 CD8+ T세포의 증가 및 OVA 특이적인 세포독성효과 등에서 가장 좋은 결과를 보였다. 또한 in vivo에서 종양 치료 및 예방효과에서도 8-h DC로 면역한 경우에 가장 우수한 종양형성 억제 효과와 생존기간 연장효과를 보였다. 현재 대부분의 수지상 세포를 이용한 항종양 백신에서 항원 탑재반응을 24시간 동안 수행하고 있으나, 본 실험의 결과로 볼 때, 8시간의 in vitro 항원 탑재가 보다 효과적인 종양특이적 CTL 반응과 항종양 면역반응을 유도함을 알 수 있다. 결론적으로 본 연구를 통하여 8시간 이상의 항원접촉은 수지상세포의 기능적 활성능력을 오히려 고갈시킬 수 있음을 제시한다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권2호
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• pp.318-324
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• 2006

In order to develop an oral vaccine to prevent H. pylori infection, we have expressed the hpaA gene of H. pylori K51 isolated from Korean patients, encoding 29-kDa HpaA that is known to be localized on the cell surface and flagella sheath, in a live delivery vector system, Lactococcus lactis. The hpaA gene, amplified by PCR using the genomic DNA of H. pylori K51, was cloned in the pGEX-2T vector, and the DNA sequence analysis revealed that the hpaA gene of H. pylori K51 had 99.7% and 94.8% identity with individual hpaA genes of the H. pylori 26695 strain (U.K) and the J99 strain (U.S.A). A polyclonal anti-HpaA antibody was raised in rats using GST-HpaA fusion protein as the antigen. The hpaA gene was inserted in an E. coli-L. lactis-shuttle vector (pMG36e) to express in L. lactis. Western blot analysis showed that the expression level of HpaA in the L. lactis transformant remained constant from the exponential phase to the stationary phase, without extracelluar secretion. These results indicate that the HpaA of H. pylori K51 was successfully expressed in L. lactis, and suggest that the recombinant L. lactis expressing HpaA may be applicable as an oral vaccine to induce a protective immune response against H. pylori.