• 한국가축번식학회지
• /
• 제19권1호
• /
• pp.35-41
• /
• 1995

본 연구는 형질전화우의 생산성 제고를 위한 일환으로서 새로운 기법인 retrovirus vector system의 이용성을 검토하고자 실시하였다. Retrovirus-producing cell은 미세주입법을 이용하여 체외생산된 1.5일(1~4-세포기) 수정란의 위란강에 주입(5~10 cells/embryo) 되었으며, 이때 사용된 retrovirus-producing cell line은 Gibbon ape leukemia virus (GaLV) envelope protein에 encapsidation되어 replication-defective retrovirus를 분비하도록 제작되었다. 주입된 유전자의 표지유전자로서 E. coli LacZ 유전자를 사용하였으며, X-gal 염색법은 발달이 유도된 상실배와 배반포 단계에 실시하여 LacZ 유전자의 발현 유무를 확인하였다. 이 실험의 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. Virus의 infectivity를 높이기 위해 사용된 polybrene의 최저농도는 5$\mu\textrm{g}$/ml이었다. 2. Retrovirus-producing cell이 주입된 1.5일 수정란의 상실배기와 배반포기로의 발달율은 29%였다. 3. 이 때의 LacZ+ 발현율은 21%였다. 4. 본 실험에 사용된 retrovirus-producing cell은 replication-competent retroviruses를 생산해 내지않는다는 것을 확인할 수 있었다.

• 한국가축번식학회지
• /
• 제21권4호
• /
• pp.397-403
• /
• 1997

Retrovirus vector를 이용한 형질전환 동물의 생산에 있어서 시급히 선행되어야 할 가장 중요한 요소는 표적세포에 대해 높은 감염도를 가진 virus를 생산하는 system의 개발이다. 이러한 문제를 해결하기 위한 일환으로 본 연구에서는 세 가지 방법을 사용하여 세포 배양액 속의 virus의 농도를 높여줌으로써 retrovirus vector system에서 생산되는 virus의 낮은 감염도를 극복하고자 하였다. 이 실험에서 얻어진 결과는 다음과 같다. 1) Virus를 생산하는 세포(pG13-LN$\beta$Z retrovirus producing cell)를 5mM의 Na-butyrate로 처리했을 때 virus titer는 소의 embryonic trachea 표적세포에서 약 3배의 증가를 나타냈다. 2) Virus가 들어있는 세포 배양액을 ultrafiltration을 통해 농축한 결과, 농축액 속의 virus titer는 대조구에 비해 약 3.6배 증가하였다. 3) 초원심분리를 통해 농축된 virus stock의 titer는 소의 embryonic trachea 표적세포에서 약 1.0$\times$105LacZ+TU/ml였는데 이 방법은 대조구에 비해 약 12.5배 만큼의 titer의 향상을 가져왔다. 따라서, 이와같이 농축된 virus stock을 이용할 경우 retrovirus vector system을 이용한 소의 수정란에의 유전자 전이율을 현저히 향상시킬 수 있으리라 사료된다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
• /
• 한국동물번식학회 2004년도 춘계학술발표대회
• /
• pp.211-211
• /
• 2004

골다공증 치료제로 이용되고 있는 hPTH (human parathyroid hormome)는 체내의 혈중 칼슘 농도를 조절하는 인간의 부갑상선 호르몬이다. 본 연구에서는 retrovirus vector system을 이용하여 hPTH를 효율적으로 생산하는 PFF (porcine fetal fibroblast) 돼지 세포를 구축하고자 하였다. hPTH 유전자는 갑상선 암 환자로부터 적출한 부갑상선 조직의 RNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하여 cloning하였으며, 이 유전자가 RSV promoter 통제하에 발현되게끔 design된 retrovirus vector를 구축하였다. (중략)

• 한국가축번식학회지
• /
• 제25권2호
• /
• pp.171-180
• /
• 2001

형질전환 가금의 생산에 있어서 retrovirus vector를 이용하는 방법은 다양한 종류의 표적세포에 대하여 retrovirus 고유의 감염성에 의한 외래 유전자의 전이가 용이하고, 전이된 유전자가 진정염색질 영역 내로 선택적으로 도입될 수 있으며 유전적으로 안정성을 나타내므로 매우 효과적인 방법이다. 그러나 가금에서는 초기 배발달에 의한 급격한 세포의 수적 증가로 인해 고감염성의 virus의 획득이 요구되므로, 이를 위하여 virus stock의 농축에 있어 보다 안정적이고 pantropic인 vesicular stomatitis virus (VSV G) glycoprotein를 envelope로 가지는 pseudotyped retrovirus vector system을 이용하였으며, marker gene으로 eGFP gene이 발현되는 retrovirus를 생산하였다. 이 virus를 이용하여 여러 가지 표적세포와 primary culture한 CEF세포를 감염시켜 GFP의 발현을 확인하였으며, 농축한 virus stock은 stage X의 계란을 선택하여 windowed egg를 제작한 후 배하층에 주입하였다. 형질전환 닭은 정상 발생한 닭에 비하여 저조한 발생율을 보였으나 PCR을 이용하여 외래 유전자의 도입을 확인한 결과 100%인 것으로 나타났다. 또한 한 개체 내에서 유전자의 도입이 폐, 간, 정소, 소장 등의 여러 장기에서 확인되었다.

• 한국가축번식학회지
• /
• 제19권4호
• /
• pp.293-305
• /
• 1996

Retrovirus는 DNA가 아닌 RNA를 유전 물질로 갖고 있는 동물 virus인데 각 virus는 RNA와 함께 크게 gag, pol. 그리고 env 등의 3가지 단백질로 구성되어 있다. gag 단백질은 virus의 내부구조를 형성하는 단백질이고, pol단백질은 감염을 통해 표적 세포에 도입된 retrovirus의 RNA를 DNA로 역전사시키는 reverse transcriptase의 역할을 하며, env단백질은 virusdml 외부를 구성하는 단백질로써 이 단백질에 의해 각 retrovirus의 종류에 따른 감염이 가능한 표적세포의 종류가 결정된다(host cell specificity). 따라서 어떤 retrovirus의 envelope단백질과 표식세포에 있는 retrovirus의 envelope 단백질에 대한 특정 receptor와의 상호 작용에 의해 세포속으로 도입된 virus의 RNA는 reverse transcriptase에 의해 DNA로 역전사된 후 표적세포의 genomic DNA에 삽입되는 특징을 가진다. 이러한 특징을 가진 retrovirus vector system은 형질 전환 동물의 생산에 있어서 현재까지의 주된 방법인 수정란의 pronucleus에의 DNA microinjection방법 보다 여러 가지 면에서 우수함에도 불구하고 쥐 이외의 다른 동물에서는 거의 이용되고 있지 않는 실정이다. 주된 원인으로는 현재 사용되고 있는 대부분의 retrovirus vector system이 쥐의 백혈병 virus를 근간으로 하기 때문에 이 system에서 생산된 virus는 쥐 이외의 다른 동물, 특히 유제류의 세포에는감염성이 아주 약하기 때문이다. 이러한 결점을 해결하기 위하여 최근에 기존의 쥐 백혈병 virus의 envelope protein을 vesicular stomatitis virus의 G protein으로 대체한 hybrid retrovirus vector system이 개발되었다. 이러한 system에서 생산되는 virus는 조류를 포함한 거의 모든 종류의 동물세포를 감염시킬 수 있으며 몇몇 특정세포에 대해서는 기존의 retrovirus vector system에 비해 1,000배 이상의 높은 감염도를 나타내는데 그 특징이 있다. 따라서 이러한 새로운 virus vector system을 이용할 경우, 보다 다양한 종에 있어서 형질전환 동물을 효율적으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라 형질전환 동물의 생산 방법 자체를 다양화 시킬 수 있다고 본다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
• /
• 한국생물공학회 2000년도 추계학술발표대회 및 bio-venture fair
• /
• pp.393-395
• /
• 2000

동결건조로 레트로바이러스를 저장 시 활성유지에 가장 좋은 첨가물로 trehalose , trehalose&PVP 를 첨가해 주었고 DSC 를 통해 열적분석을 하여 온도에 따른 레트로바이러스의 열적변화를 살펴 본 결과 첨가물을 넣어 준 경우 더욱 높은 온도에서 열적 변화가 있었다. 이것을 바탕으로 저장 온도에 따른 레트로바이러스의 활성유지를 조사하기 위해 다양한 온도에서 장기간 보관 한 결과 trehalose 를 첨가한 경우 $4^{\circ}C$ 의 온도 까지 애서도 8 주동안 60% 이상의 높은 활성을 유지하였고 trehalose&PVP 의 경우에도 비슷한 활성을 보였으나 첨가물을 넣지 않은 경우에는 모든 온도에서 40%미만의 낮은 활성도를 보였다.

• BMB Reports
• /
• 제34권2호
• /
• pp.176-181
• /
• 2001

Using a retrovirus, foreign genes can be introduced into mammalian cells. The purpose of this study is to produce a retrovirus that can make the infected cells express two genes; the human multidrug resistance gene (MDR1) and the HLA-B7 gene, which is one of the major human histocompatibility complex (MHC) class I genes. For the expression of these genes, the internal ribosome entry site (IRES) was used, which was derived from the encephalomyocarditis (EMC) virus. In order to produce retroviruses, a retroviral vector was transfected into a packaging cell line and the transfected cells were treated with vincristine, which is an anti-cancer drug and a substrate for the MDRI gene product. This study revealed that two genes were incorporated into chromosomes of selected cells and expressed in the same cells. The production of the retrovirus was confirmed by the reverse transcription (RT)-PCR of the viral RNA. The retrovirus that was produced infected mouse fibroblast cells as well as the human U937. This study showed that packaging cells produced the retroviruses, which can infect the target cells. Once the conditions for the high infectivity of retrovirus into human cells are optimized, thus virus will be used to infect hematopoietic stem cells to co-express MDRl and HLA-B7 genes, and develop the lymphocytes that can be used for the immnogene therapy.

• 한국가축번식학회지
• /
• 제19권2호
• /
• pp.89-93
• /
• 1995

In this study was demonstrate that retrovirus-mediated gene transfer is one of the promising alternatives to the conventional pronuclear DNA microinjection approach, especially in transferring the exogenous genes into the boving embryos. By co-culturing of zona of zona-free one-cell stage embryos with the retrovirus-producing cells for 24 hours followed by 6 days of culture in virus-free medium, we could get morulae and blastocysts expressing the E. coli LacZ genes which were transferred by our retrovirus vector. The results obtained in this study are summarized as follows : 1. Addition of 5$\mu\textrm{g}$/ml of polybrene in the embryo and virus-producing cell co-culture medium did not affect development of zona-free one-cell embryo. 2. Compared with the intact embryos removal of zona at one-cell stage before co-culturing with the virus-producing cells for one day caused only slight decrease of embryo develpment. 3. Co-culture of 625 zona-free one-cell stage embryos with the virus-producing cells resulted in 65(10.4%) morulae or blastocysts, and 12.3%(8/65) of the morulae or blastocysts were E. coli LacZ positive.

• Reproductive and Developmental Biology
• /
• 제34권3호
• /
• pp.257-262
• /
• 2010

The purpose of this study is to establish a basic culture system enabling in vitro culture of chicken blastodermal cells and to test the feasibility of retrovirus-mediated gene transfer to the cultured cells. The blastodermal cells were isolated from freshly laid eggs of stage X and cultured with or without STO feeder layer cells. Stem cell-like morphology was maintained after multiple passages and RT-PCR analysis proved expression of several stem cell specific genes. Immunocytochemical analysis using antibodies of anti-EMA-1 and anti-SSEA-1 also showed the feature of stem cells. Infection of the cultured blastodermal cells with LNCGW retrovirus vector resulted in successful transfer of foreign genes. The results of this study may be useful in establishing stem cell-mediated transgenic chicken production.

• 한국가금학회:학술대회논문집
• /
• 한국가금학회 2003년도 제20차 정기총회 및 학술발표회
• /
• pp.95-96
• /
• 2003

본 연구에서는 VSV-G(vesicular stomatitis virus G glycoprotein)로 포장된 MoMLV(Moloney murine leukemia virus) retrovirus vector system을 이용하여 GFP가 발현되는 형질전환 닭을 생산하고자 하였다. GFP 유전자를 retroviral vector 내의 RSV(Rous sarcoma virus) promoter의 조절 하에 도입한 후, Gp293 세포주에서 virus 형태로 생산하였으며, 이 virus를 초원심분리로 고농축하여 stage X 계란의 배 반엽 층에 주입하여 GFP가 발현되는 형질전환 닭을 생산하였다. 생산된 닭에서의 GFP의 발현은 epifluorescence stereomicroscope를 이용하여 확인하였다. 이 방법은 기존의 여러 형질전환 가금 방법에 비하여 기술적인 용이성과 경제성을 가지므로(Muramatsu, Park and Okumura 1998), 매우 효율적이고 주목할 만한 형질전환 가금 생산 방법으로 사료된다. 형질전환 가금의 생산에서 retrovirus vector를 이용하는 방법은 다양한 종류의 표적세포에 대하여 retrovirus 고유의 감염성에 의한 외래 유전자의 전이가 용이하고, 전이된 유전자가 진정염색질 영역 내로 선택적으로 도입될 수 있으며 유전적으로 안정성을 나타내므로 매우 효과적인 방법이다. 그러나 가금에서는 초기 배 발달에 의한 급격한 세포의 수적 증가로 인해 고감염성 virus의 획득이 요구되므로, 본 연구에서는 virus의 농축에 있어 보다 안정적이고 숙주 범위에 있어서 pantropic한 VSV-G에 기반을 둔 retrovirus vector system을 확립하였다. 이 system은 기존의 형질전환 닭의 생산방법에 비해 외래 유전자의 전이에 있어서 매우 효과적인 것으로 확인되었으며, 또한 여러 유용한 생리활성물질을 분비하는 형질전환 동물의 생산에 있어서 상당한 기여를 할 것으로 사료된다.