• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제32권4호
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• pp.484-492
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• 2022

Lichenase is an enzyme mainly implicated in the degradation of polysaccharides in the cell walls of grains. Emerging evidence shows that a highly efficient expression of a thermostable recombinant lichenase holds considerable promise for application in the beer-brewing and animal feed industries. Herein, we cloned a lichenase gene (CelA203) from Bacillus subtilis B110 and expressed it in E. coli. This gene contains an ORF of 729 bp, encoding a protein with 242 amino acids and a calculated molecular mass of 27.3 kDa. According to the zymogram results, purified CelA203 existed in two forms, a monomer, and a tetramer, but only the tetramer had potent enzymatic activity. CelA203 remained stable over a broad pH and temperature range and retained 40% activity at 70℃ for 1 h. The K_m and V_max of CelA203 towards barley β-glucan and lichenan were 3.98 mg/ml, 1017.17 U/mg, and 2.78 mg/ml, 198.24 U/mg, respectively. Furthermore, trisaccharide and tetrasaccharide were the main products obtained from CelA203-mediated hydrolysis of deactivated oat bran. These findings demonstrate a promising role for CelA203 in the production of oligosaccharides in animal feed and brewing industries.

• 농업과학연구
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• 제48권4호
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• pp.1003-1013
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• 2021

Thioredoxin (TRX) protein is an antioxidant responsible for reducing other proteins by exchanging cysteine thiol-disulfide and is also known for its anti-allergic and anti-aging properties. On the other hand, epidermal growth factor (EGF) is an important material used in the cosmetics industry and an essential protein necessary for dermal wound healing facilitated by the proliferation and migration of keratinocytes. EGF also assists in the formation of granulation tissues and stimulates the motility of fibroblasts. Hence, genetically modified soybeans were developed to overexpress these industrially important proteins for mass production. A single-dose oral-toxicity-based study was conducted to evaluate the potential toxic effects of TRX and EGF proteins, as safety assessments are necessary for the commercial use of seed-specific protein-expressing transgenic soybeans. To achieve this rationale, TRX and EGF proteins were mass purified from recombinant E. coli. The single-dose oral-toxicity tests of the TRX and EGF proteins were carried out in six-week old male and female Institute of Cancer Research (ICR) mice. The initial evaluation of the single-dose TRF and EGF treatments was based on monitoring the toxicity signatures and mortality rates among the mice, and the resultant mortality rates did not show any specific clinical symptoms related to the proteins. Furthermore, no significant differences were observed in the weights between the treatment and control groups of male and female ICR mice. After 14 days of treatment, no differences were observed in the autopsy reports between the various treatment and control groups. These results suggest that the minimum lethal dose of TRX and EGF proteins is higher than the allowed 2,000 mg·kg^-1 limit.

• 생명과학회지
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• 제19권5호
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• pp.573-580
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• 2009

화학적 변형 방식에 의한 트로포마이오신과 액틴의 상호작용을 규명하기 위하여 액틴결합에 중요한 역할을 하는 C-말단부위의 아미노산 잔기 276 또는 277을 단일 시스테인 잔기로 치환한 돌연변이 트로포마이오신을 제조하여 대장균에서 대량 발현시킨 후 액틴 결합력을 측정하였다. 잔기277을 시스테인 잔기로 치환시킨 TM24(QC) 및 TM29(HC)는 액틴 결합 성질을 잃어버렸을 뿐만 아니라 트로포닌 존재 하에서도 액틴결합력이 증가하지 않았다. 이 결과는 잔기 277이 트로포마이신 기능에 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다. 반면 잔기 276을 시스테인 잔기로 치환한 TM22(CT) 및 TM23(CA)는 액틴과 비교적 잘 결합하였을 뿐만 아니라 트로포닌 존재 하에서 액틴결합력이 증가하였다. 따라서 TM23(CA)는 시스테인 잔기를 도입하여도 트로포마이오신의 기능을 유지하였으며 향후 화학적 변형 연구를 위한 도구로 중요하게 사용될 수 있을 것이다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제33권4호
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• pp.281-287
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• 2005

Paenibacillus polymyxa 유래의 endoinulinase 유전자(inu, 2.733 kb, E.C 3.2.1.7)를 Saccharomyces cerevisiae에 발현시키기 위해 대장균과 효모의 shuttle vector (GALl promoter함유)에 subcloning하여 구축된 pYGENIU27 (8.6 kb) plasmid를 S. cerevisiae SEY2102에 형질전환하였다. Uracil이 결핍된 SD배지와 inulin이 포함된 배지에서 효모 형질전환체를 선별하였다. 효모 형질전환체의 배양에서 endoinulinase는 periplasmic space에 다량 존재함이 확인되었다. YPDG배지에서 재조합 endoinulinase는 총 활성 1.81unit/ml으로 생산되었다. Inulooligosaccharides (IOSs) 생산을 위한 효소의 최적 반응 조건으로 pH 8.0,반응온도 $45^{\circ}C$, 기질은 Jerusalem artichoke로 결정되었다. 효소활성은 pH 10.0에서도 안정적으로 유지되었으며, 최적 반응 조건 (ginulin당 36 unit효소 이용)에서 반응 10분 후부터 IOSs가 생산되기 시작하였다. 생성된 IOSs의 구성분으로 inulobiose (F2), inulotriose (F3)와 inulotetraose (F4)가 생성되었고, 이중에서 F3가 주성분이었다. 이상의 결과는 효모에서 생산된 재조합 endoinulinase를 이용하여 inulin으로부터 기능성 감미소재인 IOSs의 산업적 생산을 위한 기초결과로 활용될 것이다.

• Molecules and Cells
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• 제26권6호
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• pp.536-547
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• 2008

Anthocyanidin synthase (ANS, leucoanthocyanidin oxygenase), a 2-oxoglutarate iron-dependent oxygenase, catalyzed the penultimate step in the biosynthesis of the anthocyanin class of flavonoids, from the colorless leucoanthocyanidins to the colored anthocyanidins. The full-length cDNA and genomic DNA sequences of ANS gene (designated as GbANS) were isolated from Ginkgo biloba for the first time. The full-length cDNA of GbANS contained a 1062-bp open reading frame (ORF) encoding a 354-amino-acid protein. The genomic DNA analysis showed that GbANS gene had three exons and two introns. The deduced GbANS protein showed high identities to other plant ANSs. The conserved amino acids (H-X-D) ligating ferrous iron and residues (R-X-S) participating in 2-oxoglutarate binding were found in GbANS at the similar positions like other ANSs. Southern blot analysis indicated that GbANS belonged to a multi-gene family. The expression analysis by real-time PCR showed that GbANS expressed in a tissue-specific manner in G. biloba. GbANS was also found to be up-regulated by all of the six tested abiotic stresses, UV-B, abscisic acid, sucrose, salicylic acid, cold and ethylene, consistent with the promoter region analysis of GbANS. The recombinant protein was successfully expressed in E. coli strain with pET-28a vector. The in vitro enzyme activity assay by HPLC indicated that recombinant GbANS protein could catalyze the formation the cyanidin from leucocyanidin and conversion of dihydroquercetin to quercetin, suggesting GbANS is a bifunctional enzyme within the anthocyanidin and flavonol biosynthetic pathway.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제33권3호
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• pp.193-199
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• 2018

본 연구에서는 유전자 변형 옥수수(GM 옥수수)에 특이한 단크론성 항체를 개발하고 이에 대한 특성을 확인하는 연구를 수행하고자 하였다. 먼저 형질전환 대장균으로부터 PAT 단백질을 발현시킬 수 있는 시스템을 확립하였고, 재조합 PAT 단백질을 대량 생산하여 항원으로 사용하였다. 준비된 항원을 면역한 결과 재조합 PAT 단백질의 항원성은 매우 높은 것으로 확인되었으며, 세포융합과 클로닝을 통해 12 종의 hybridoma를 확립하였고 western blot 결과 10 종의 hybridoma가 재조합 PAT 단백질과 강한 반응성을 나타내었다. 10종의 hybridoma가 생산하는 항체가 실제 GM 옥수수에 반응하는지를 추가의 western blot으로 분석한 결과 2종의 단크론성 항체(PATmAb-7 and PATmAb-12)가 재조합 PAT 단백질뿐만 아니라 실제 GM 옥수수 중 PAT와 반응하는 것으로 확인되었다. 항체를 대량 생산하고 정제한 후 2종의 항체는 SDS-PAGE 상에서 대표적인 항체의 분리패턴(heavy와 light chain)을 나타내었고, 전형적인 $IgG_1$과 ${\kappa}$ type으로 확인되었다. 정제된 단크론성 항체는 특성을 조사한 결과 다른 GMO에서 발현될 수 있는 재조합 단백질과 non-GM 옥수수 추출물에는 반응성이 없고 PAT 단백질에만 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다. PATmAb-7 를 이용한 간접효소면역분석법의 검출한계는 0.3 ng/mL 수준으로 기준의 유전자변형 콩 면역분석법과 비교했을 때 높은 민감도를 나타내었다. 이상의 결과로 볼 때 개발된 2종의 항체(PATmAb-7 and PATmAb-12)는 GM 옥수수에서 발현되는 PAT 단백질에 특이적으로 반응하는 항체로 확인되었고, 2종의 항체를 이용한 면역분석법과 바이오센서의 개발 가능성을 제시할 수 있었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제30권11호
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• pp.1720-1728
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• 2020

We have previously characterized AprESJ4, the major fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis SJ4 (Yao et al., 2019). During that study, we observed a 68 kDa protein with fibrinolytic activity. In this study, we cloned the gene (vprSJ4) encoding the 68 kDa protein, a mature Vpr and minor protease secreted by Bacillus species. vprSJ4 encodes a preproenzyme consisting of 810 amino acids (aa) including signal sequence (28 aa) and prosequence (132 aa). The mature enzyme (650 aa) has a predicted molecular weight of 68,467.35. Unlike Vprs from other B. subtilis strains, VprSJ4 has 4 additional amino acids (DEFA) at the C-terminus. vprSJ4 was overexpressed in Escherichia coli. PreproVprSJ4 was localized in inclusion bodies, and subjected to in vitro renaturation and purification by an affinity column. SDS-PAGE and western blot showed that autoprocessing of preproVprSJ4 occurred and 68 kDa and smaller proteins were produced. The optimum pH and temperature of the recombinant VprSJ4 were pH 7.0 and 40℃, respectively. Kinetic parameters of recombinant VprSJ4 were measured by using an artificial substrate, N-succinyl-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilide. Coexpression of vprSJ4 and aprESJ4 using pHY300PLK increased the fibrinolytic activity a further 117% when compared with aprESJ4 single expression using the same vector in B. subtilis WB600.

• 고려인삼학회:학술대회논문집
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• 고려인삼학회 1998년도 Advances in Ginseng Research - Proceedings of the 7th International Symposium on Ginseng -
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• pp.231-243
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• 1998

In the present study, we provide evidence that ginsenoside $Rh_2$ (G-$Rh_2$) as well as staurosporine induces apoptosis of human hepatoma SK-HEP-1 cells by caspase 3-mediated processing of $p21^{WAFI/CIPI}$ in the early stage of apoptosls. Immunoblottings showed that G-$Rh_2$ as well as statrosporine induced the processing of caspase-3 to an active form, pl7. In stable Bcl-2 transfectants however, G-$Rh_2$ induced DNA fragmentation, while staurosporine did not. In the early stage of apoptosis, $p21^{WAFI/CIPI}$ was detected to undergo proteolytic processing specifically conducted by caspase-3. $p21^{WAFI/CIPI}$ translated in vitro was cleaved into a p14 fragment, when incubated with cell extracts obtained from either G-$Rh_2$- or staurosporine-treated cells. Cleavage was equally inhibited in both cases by adding Ac-DEVD-cho, a specific caspase-3 inhibitor, but not by Ac-YVkD-cho, a specific caspase-l inhibitor. Similarly, $p21^{WAFI/CIPI}$ was efficiently leaved by recombinant caspase-3 overexpressed in E. coli. Moreover, the endogenous $p21^{WAFI/CIPI}$ of untreated-cell extracts was also cleaved by recombinant caspase-3. Mutation analysis allowed identification of two caspase-3 cleavage sites, $DHVD^{112}$/L and $SMTD^{149}$/F, which are located within, or near the interaction domains for cyclins, Cdks, and PCNA. Taken together, these results show that G-$Rh_2$ as well as staurosporine increases caspase-3 activity, which in turn directly cleaves $p21^{WAFI/CIPI}$ resulting in elevation of Cdk kinase activity in the early stages of apoptosis. We propose that proteolytic cleavage of $p21^{WAFI/CIPI}$ is a functionally relevant event that allows unleashing the cyclin/Cdk activity from the inhibitor seen in the earlier stage of apoptosis, the event of which may be associated with the triggering mechanism for the execution of apoptosis.

• 생명과학회지
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• 제15권6호
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• pp.916-922
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• 2005

E3 ligase로 알려진 Parkin은 protein quality control에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 이런 quality control system의 이상으로 나타나는 퇴행성 뇌질환에도 밀접한 연관성이었다. 이와 같이 생체의 필수적인 업무를 담당하는 Parkin의 기능을 생화학적 측면에서 연구하기 위해서는 고 순도의 단백질을 다량 정제할 수 있는 시스템이 필요하나, 아직까지 Parkin의 발현 양상과 정제법에 관한 연구가 미흡한 상태이다. 본 연구에서는 pCEX system을 이용하여 Parkin을 대장균에서 overexpression시켜 단일 스텝으로 정제할 수 있는 방법을 정립하였다. 저온의 배양조건에서 0.01 mM의 IPTC로 발현을 유도한 결과 $90\%$ 이상의 순도를 가지는 완전한 크기의 Parkin을 정제할 수 있었다. 또한, 여러 tag을 갖는 Parkin plasmid를 제작하였을 뿐만 아니라, 이들을 HEK293 세포에 transfection하여 Parkin의 발현 양상을 비교 분석하였다. 그 결과 Parkin의 N-말단에 pretense에 민감한 절단 부위가 존재한다는 사실을 확인하였다. 본 연구에서 정립한 Parkin 정제법과 포유류 세포에서 Parkin의 발현 양상에 대한 결과는 Parkin의 기질을 탐색하고,그들이 Parkin의 효소 활성 및 기능에 미치는 영향을 조사하기 위한 다양한 연구에 활용할 수 있을 것이다.

• 생명과학회지
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• 제14권3호
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• pp.435-440
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• 2004

초호열성 고세균 Thermococcus litoralis 유래의 4-$\alpha$-glucanotransferase는 클로닝 되어 염기배열이 밝혀졌으며, 대장균에서 발현되었다 발현된 이 효소는 기능적인 면에서는 D-enzyme과 유사하지만 아미노산 배열에서는 큰 차이점을 나타내었다. 이 효소는 cycloamylose를 생산하는 새로운 기능적인 특성을 가지고 있어 당대사 관련 효소 단백질에 관한 연구의 중요성 때문에 산업적으로 많은 각광을 받고 있다. 본 연구는 초호열성 고세균 T. litoris 유래 4-$\alpha$-glucanotransferase 유전자를 부위 특이적 변이 방법으로 재조합하여 lac와 T7프로모터를 이용해서 대장균 발현 벡터 시스템에서 대량발현 시켰다. 대장균에서 대량 발현된 재조합 효소 단백질은 열처리, 501빌Butyl-Toyopearl, Mono Q 크로마티그래피 방법에 의하여 간단히 정제되었다. 정제된 재조합 효소 단백질은 본래의 효소 단백질과 같은 기능을 가지고 있는 것으로 확인되었다.