• KSBB Journal
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• 제14권6호
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• pp.724-730
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• 1999

본 연구에서는 인뇨에서 분리 정제한 urokinase와 유전자 재조합 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 배양액으로부터 분리 정제한 pro-urokinase의 물리화학적 특성과 혈액 내에서의 효소활성을 비교 분석하였다. Two chain form인 urokinase와 single chain form인 pro-urokinase를 각각 순수 분리한 후, electrophoresis한 결과 모두 54 kd의 단일밴드를 나타냈다. 그러나 urokinase는 환원시켰을 때 33 kd과 21 kd으로 나누어짐을 확인하였으나 gel filtration결과 분자량이 54 kd 정도임을 확인되어 용액 내에서 단일분자로 존재함을 알 수 있었다. Urokinase와 pro-urokinase가 물리화학적으로 거의 동일한 구조를 가졌다는 사실은 isoelectro focusing에 의한 pI 값이 모두 8.6으로 동일하다는 점과, 아미노산 조성을 분석한 결과 동일하다는 사실로도 알 수 있었다. N-terminal 아미노산 서열을 분석한 결과, urokinase는 이중사슬구조이므로 N-terminal이 두개 존재하여 pro-urokinase의 서열(Ser-Asn-Glu-Leu-His-Gln-Val-Pro-Ser-Asn)이외에도, 159번째의 Ile다음부터 Ile-Gly-Gly-Glu-Phe-Thr-Thr-Ile-Glu가 같은 peak로 나타남을 확인하였다. 효소활성 조사결과 pro-urokinase와 urokinase는 모두 농도 의존적으로 혈전용해 활성을 보였으나, 특이하게도 짧은 반응시간동안에는 urokinase가 동일 농도 하에서 강한 활성을 보인 반면, 2시간이 지난 오랜 반응조건에서는 pro-urokinase가 혈전용해활성을 나타내었다. Fibrinogen에 대한 분해활성을 조사한 결과, urokinase는 혈장 내 fibrinogen을 상당히 손상시키지만, pro-urokinase는 거의 영향을 주지 않아 혈전선택성이 매우 좋음을 알 수 있었다.

• KSBB Journal
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• 제5권2호
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• pp.183-189
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• 1990

1,000l 규모의 인뇨로부터 순수한 urokinase를 정제하는 새로운 공정이 고안되었다. 2가 금속이온인 아연을 첨가하여 선택적으로 urokinase를 침전시켰으며, 이 방법은 뇨 중에 포함된 다른 단백질을 100~1,000배 농축할때도 사용할 수 있으며 10~20배의 경제효과를 얻었다. 침전물 속에 포함된 urokinate를 경제적으로 용출할기 위하여 0.1M EDTA/0.5M glycine, pH 9.0용액이 조성되었고, 용출액속에 포함된 높은 농도의 salt와 ion,뇨색소 등이 CM-Toyopeal column에 의해 신속하고 효과적으로 제거되었다. 최종적으로 사용된 benzamidine-Sepharose chromatog-raphy는 urokinase 정졔에 매우 효과적이었다. 이상의 공정을 통해, 1,000liter의 인뇨로부터 3$\times$$O^6IO$의 urokinase가 순수 정제 되었으며, 수욜은 약 50%, 정제도는 1,300배이었다. 또한 urokinase중에 12~14%의 pro-urokinase가 함유되어 있음이 확인되었다.

• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제8권2호
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• pp.162-165
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• 2003

In order to study the secretion of the human urokinase-type plasminogen activator, u-PA, from the yeast yarrowia lipolytica, three kinds of integrative expression vector were constructed. These vectors differed only in their secretion control legions, pre-, pre-dip-(dipeptide Stretch) or pre-dip-pro sequences of the alkaline extracellular protease, which were joined inflame to the human u-PA cDNA. The recombinant Y. lipolytica Strains, transformed with the expression vectors, secreted the hyperglycosylated u-PA. A fibrin plate assay of the culture supernatants showed that the hyperglycosylated u-PA proteins could catalyze fibrinolysis, and that the pre-dip sequence was the most efficient secretory signal for the secretion of the u-PA from Y. lipolyica. This result suggests that Y. lipolytica can be developed as a potential host for the production of recombinant human u-PA.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제18권4호
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• pp.401-405
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• 1990

5 혈청을 포함한 DMEM 배지에 갑상세포주 579를 연속배양하여 약 $5.7 \times 10^{-8}$g/h /cell에 해당하는 pro-UK의 비생산속도를 얻을 수 있었다. 또한 배지의 이동속도가 증가할 수록 glutamine의 소비속도가 증가하는 반면 ammonia 생산속도는 일정하게 유지되는, glutamine의 완전동화에의한 물질생산증가 현상을 나타냈다. 5mM의 glucose와 2mM의 glutamine, 포화용존 공기의 10에 해당하는 용존산소 및 pH 6.2의 maintenance 생육 조건하에서 약 15일간 유지시켜, $12\times 10^{-8}$g of pro-UK/h/cell의 최대 비생산속도와 0.226mg/g of glucose의 생산수율을 얻었으며, 이는 10ml/min의 배지 이동속도를 유지하는 연속배양 조건에서 매일 0.223mg의 pro-KU를 생산할 수 있을을 의미한다.

• 생약학회지
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• 제29권3호
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• pp.149-154
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• 1998

Binding of urokinase-type plasminogen activator to its cellular receptor accelerate production of plasmin from plasminogen on the cell surface. Plasmin can digest extracellular matrix components and basement membranes through activating certain proMMPs, which is related to the invasiveness to the cells. Plasmin also acts the regulation of blood coagulation and relates closely to cardiovascular diseases such as stroke and coronary occlusion. Therefore, its inhibitors may be useful as antimetastatic agents and to the treatment of cardiovascular diseases. To search for plasmin inhibitors from plant resources, we screened plasmin inhibitory activities with 76 methanol extract of plant species. Among them, three plant samples showed strong inhibitory activities (>70%) and thirteen plant samples showed more than 50% inhibitory activities of plasmin. Their inhibitory activities were not directly related with uPA inhibitory activites and cell viability.

• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제6권2호
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• pp.117-127
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• 2001

The high-level expression of a human single chain urokinase-type plasminogen activator (scu-PA) was achieved by employing a methotrexate (MTX)-dependent gene amplification system in Chinese hamster ovary (CHO) cells. By cotransfecting and coamplifying a scu-PA expression plasmid and dihydrofolate reductase (DHFR) minigene, several scu-PA expressing CHO cell lines were selected and gene-amplified. These recombinant cell lines, NGpUKs, secreted a completely processed scu-PA of 54 kD and up to 60mg/L was accumulated in the culture medium when they were adapted to an optimal MTX concentration. Over 95% of the scu-PA expressed was secreted in the culture medium and identified having the proper function of a plasminogen activator when activated by plasmin. Based on a genomic Southern analysis, a representative subclone, MGpUK-5, exhibited MTX-dependent scu-PA gene amplification, plus the initial single-copy gene of scu-PA eventually turned into about 150 copies of the amplified gene of scu-PA after gradual adaptation to 2.0$\mu$M of MTX. Meanwhile, the transcripts kof the scu-PA gene increased, although -early saturation of transcription was identified at 0.1$\mu$M of MTX. The scu-PA production by the MGpUK-5 subclone also increased relative to the gene amplification and increased transcripts, however, the relationship was not linearly proportional. Accordingly, since the MGpUK cell lines expressed elevated levels of enzymatically active scu-PA, these cell lines could be applied to the largescale production of scu-PA.

• 영재교육연구
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• 제12권2호
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• pp.1-15
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• 2002

본 연구의 목적은 부모가 지각한 유아 영재의 영재적 특성과 연령에 따른 발달상 변화를 알아보고자 만 30개월부터 6세 10개월까지 유아영재교육을 받고 있는 148명 유아 영재아동을 대상으로 하여 30개월부터 47개월까지, 48개월부터 60개월까지 및 60개월부터 6개 10개월까지를 유아 1, 2, 3 집단으로 세분화하여 살펴보았다. 연구결과, 첫째, 부모에 의해 유아영재를 확인하고 발견할 수 있는 두드러진 영재적 특성이 있으며, 주요 특성들로는 ‘우수한 기억력’, ‘호기심이 많다’, ‘2살에 숫자를 읽고 이해한다’, ‘학습의 즐거움과 학습 동기가 강하다’, ‘주의집중이 강하고 길다’, ‘책읽기를 선호한다’, ‘수준높은 언어를 사용한다’, ‘기발한 생각을 한다’, ‘어렵거나 왜라는 질문이 많다’, ‘자신에게 만족하며 독립적이다’ 등으로서 거의 인지적 특성들이었다. 둘째, 어린 유아에서부터 학령전기 유아까지 영재적 특성이 비슷하게 나타나지만, 유아의 연령이 많아질수록 영재적 특성의 강도가 증가하고 뚜렷해지는 경향성을 띄었다. 셋째, 어린 유아에서 나타나는 영재적 특성과 학령전기 유아단계에서 나타나는 영재적 특성간에는 일부 항목에서 뚜렷한 변화를 보였다. 일부 특성은 연령이 높아질수록 점차 줄어들지만, 일부 특성은 연령이 높아질수록 점차 증가하는 모습을 보였다. 이러한 연구결과는 부모의 주관적 지각임에도 불구하고 유아영재 판별과정에서 중요한 정보원으로 신뢰롭게 사용할 수 있는 유아영재의 두드러진 특징이 있으며, 이런 정보를 사용할 때는 유아의 세부적인 연령을 고려할 필요가 있음을 시사한다.동안에는 urokinase가 동일 농도 하에서 강한 활성을 보인 반면, 2시간이 지난 오랜 반응조건에서는 pro-urokinase가 혈전용해활성을 나타내었다. Fibrinogen에 대한 분해활성을 조사한 결과, urokinase는 혈장 내 fibrinogen을 상당히 손상시키지만, pro-urokinase는 거의 영향을 주지 않아 혈전선택성이 매우 좋음을 알 수 있었다.고 빠르게 판단할 수 있을 것이다. 단백질 재접힘 과정에서 이러한 개념의 성공적 도입은 단백질 회수 수율을 높임으로써 생물분리공정 분야의 기술 발전에 이바지 하리라 사료된다.$^{\circ}C$에서는 60분동안 효소활성이 거의 상실되지 않았다. 정제된 효소는 ethanol과 chloroform 처리에는 안정하였으나 12mM AT 와 0.1mM $NaN_3$ 및 1mM KCN에 의해 90% 이상의 활성이 억제되었다.이에 근거하여 서울시 학생들($7{\sim}18$세)의 만성신부전증 유병률은 1백만명당 5.7명으로 추정되었다. 결론 : 서울시내 학생들 중 11세, 14세, 17세 3개 군에서 한 번 검사로 확인된 무증상 단백뇨의 유병률은 0.28%(약 2.8명/1,000명)이었고 이들중 약 5%만이 3차검사에서 신질환이 의심되었으며 이에 따른 신질환 유병률은 1만명당 1.4명이었다. $7{\sim}18$세 연령층에서 무증상으로 발생하는 사구체 신질환 중에는 IgA 신병증의 유병률이 가장 높아 1만명당 0.64명으로 추정되었고 만성신부전증의 유병률은 1백만명당

• 한국수정란이식학회지
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• 제17권2호
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• pp.101-108
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• 2002

Human Prourokinase (proUK) offers potential as a novel agent with improved fibrin specificity and, as such, may offer advantages as an attractive alternative to urokinase that is associated with clinical benefits in patients with acute peripheral arterial occlusion. For production of transgenic cow as human proUK bioreacotor, we conducted this study to establish efficient production system for bovine transgenic embryos by somatic cell nuclear transfer (NT) using human prourokinase gene transfected donor cell. An expression plasmid for human prourokinase was constructed by inserting a bovine beta-casein promoter, a green fluorescent protein (GFP) marker gene, and human prourokinase target gene into a pcDNA3 plasmid. Cumulus cells were used as donor cell and transfected with the expression plasmid using the Fugene 6 as a carrier. To increase the efficiency for the production of transgenic NT, development rates were compared between non-transfected and transfected cell in experiment 1, and in experiment 2, development rates were compared according to level of GFP expression in donor cells. In experiment 1, development rates of non-transgenic NT embryos were significantly higher than transgenic NT embryos (43.3 vs. 28.4％). In experiment 2, there were no significant differences in fusion rates (85.4 vs. 78.9％) and cleavage rates (78.7 vs. 84.4％) between low and high expressed cells. However, development rates to blastocyst were higher in low expressed cells (17.0 vs. 33.3％), and GFP expression rates in blastocyst were higher in high expressed cells (75.0 vs. 43.3％), significantly.

• 한국미생물생명공학회:학술대회논문집
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• 한국미생물생명공학회 2000년도 Proceedings of 2000 KSAM International Symposium and Spring Meeting
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• pp.178-181
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• 2000

In order to develop the novel gene expression system, we introduced new control elements which could influence the foreign gene expression in animal cells. When the foreign genes are introduced into the genome of higher eukaryotic cells, the expressions from these integrated genes are often low and can vary greatly depending on the positions of the integration sites due to the complex nature of the chromatin structures (1). First we screened the various DNA sequence elements which can function as an insulator of gene expression from these position effects and can cooperate with the SV40 enhancer/promoter. Among the several DNA elements from the various sources, we identified the particular DNA element which confers the increased frequency of the positive colonies, assayed by the reporter gene from stable selections indicating significantly reduced position effects. This element also showed the several fold-increased expression level as well as the copy-number dependent expression with host cell specificity. Second we modified the transcription termination element where we introduced the specific terminator in combination with SV40 polyA signal. This modified terminator showed the increased efficiency and the level of the gene expression. By combining these two elements, we made the animal cell expression system and tested successfully for the recombinant protein productions of TGF ${\beta}$-soluble receptor, Antithrombin III, and single chain Pro-Urokinase. [Supported by grants from MOCIE]