형질 전환된 식물세포배양에서 비이온성 계면활성제인 Pluronic F-68 의 첨가가 미치는 영향을 연구하였다. Pluronic F-68 첨가시 세포생장에 미치는 영향은 크지 않았으며 5 g/L 첨가시 배지내 hGM-CSF의 양은 대조구에 비해 2배 더 증가하였다. 첨가 시기 최적화 실험을 통하여 배양 초기부터 첨가하는 것이 유리할 것으로 판단된다. 또한 Pluronic F-68 의 첨가가 세포크기를 감소시킴을 알 수 있었다. 이는 Pluronic F-68 이 세포막과 상호 작용하여 세포막 투과성을 증진시킴으로써 생산된 hGM-CSF의 배지 내로의 분비를 촉진시킴을 간접적으로 보여주는 결과이다.
본 연구에서는 Pluronic F-68을 해동 후 회복배지에 적용하여, 동결보존된 형질전환 식물세포의 생장 증진을 도모하였다. Pluronic F-68은 세포표면의 소수성을 감소시켰을 뿐만 아니라, 세포의 투과성을 증진시켜 세포와 직접 상호 작용할 수 있음을 관찰하였다. 또한 Pluronic F-68의 첨가에 의해 재조합단백질의 발현에 부정적인 영향을 보이지 않음을 확인하였다. 따라서 동결보존시 해동 후 회복배지에 Pluronic F-68의 첨가는 식물세포의 신속하고 효율적인 대량 현탁배양을 가능하게 할 수 있다.
The effects of Pluronic F-68, a non-ionic surfactant, on the growth and physical characteristics of Digitalis lanata suspension cultures were investigated in aqueous two-phase systems (ATPSs) composed of $4.5\%$ polyethylene glycol (PEG) 20,000 and $2.8\%$ crude dextran. In the range of 0.1-10.0 g $1^{-1}$, Pluronic F-68 enhanced the maximum cell density in a medium with ATPSs, even though Pluronic F-68 did not affect cell growth in a normal growth medium. In terms of physical properties of ATPSs with cell suspension cultures, 0.2 g $1^{-1}$ of Pluronic F-68 reduced viscosity by up to $40\%$, while 0.1 g $1^{-1}$ of Pluronic F-68 significantly enhanced the oxygen transfer rate. In addition, we successfully performed aqueous two-phase cultivation in a 5-1 stirred tank bioreactor with 0.5 g $1^{-1}$ of Pluronic F-68, and discovered that cell growth in ATPSs was similar to that in normal growth medium.
본 연구에서는 수성이상계에서 Pluronic F-68과 산소전달물질을 적용하여, 물질전달과 산소전달을 증가시켜 당귀세포의 증식을 향상시켰다. 특히 산소전달물질인 n-hexadecane이 Pluronic F-68보다 수성이상계에서의 당귀 세포증식에 더 긍정적임을 확인하였다. 따라서 Pluronic F-68과 적절한 산소 전달물질의 첨가는 수성이상계 뿐만 아니라 대량배양을 위한 고농도배양 등에 효과적으로 적용가능하리라 사료된다.
Shake flask를 사용하여 M. piperita 세포의 현탁 배양에서의 fungal elicitor, pluronic F-B8, methylcellulose의 영향에 대하여 연구하였다. 그 결과 Rhodotorula rubra라는 균주에서 추출한 fungalelicitor를 처리하여 약 2배 정도 박하정유 생산의 증가를 관찰하였고 100 rpm의 교반속도에서 낮은 농도의 Pluronic F-68, methylcellulose 첨가에 의해 박하세포의 성장이 증진되었다.
유가식배양을 통한 고농도배양에서 계면활성제와 산소전달물질의 첨가는 세포의 고밀도와 배지의 고점도로 인해 발생하는 nutrient의 물질전달제한과 산소부족현상을 효과적으로 해결하였다. Pluronic 10R-5는 Pluronic F-68과 같은 triblock copolymer 구조이며 세포생장의 저해를 나타내지 않았다. 그러나 diblock copolymer구조이며 소수성 부분이 hydrocarbon block인 Plurafac A-38은 세포의 생장을 저해함을 관찰할 수 있었다. 따라서 장기간의 유가식배양이나 perfusion 배양을 수행할 경우 세포의 생존도를 증대시켜 유용물질의 생산성을 높일 수 있으며 여러 형태의 bioreactor에서 고농도 배양을 가능케 하여 유용물질 생산성을 높일수 있을 것이라고 기대된다.
미량의 Pluronics가 첨가된 PLLA/l,4-dioxane/water의 삼성분계상을 온도 변화로 유도된상 분리법을 이용하여 10~300 $\mu\textrm{m}$의 공극 크기를 가지며 공극 간의 연결성이 우수한 PLLA 다공성 지지체를 제조하였다. 순수한 PLLA 용액에 Pluronics를 첨가하면 상 분리 온도가 P-123< F-68< F-127 순서로 순차적으로 상승한다. 이는 Pluronics의 양 말단 사슬인 PEO의 영향으로 상분리 진행이 촉진되기 때문이다. 상 분리 온도의 상승으로 스피노달 영역을 증가시켜 높은 온도에서 상 분리 유도가 가능하게 된다. 또한 상 분리 진행 시간 동안에는 계면에 흡수된 Pluronics가 거대 구조를 안정화시켜 상 분리 진행 속도를 지연시키게 된다.
기존의 무혈청 배지에 첨가하던 BSA/acid를 acid/Pluronic F-68 emulsion으로 대치하여도 세포성장에는 전혀 지장이 없었다. BSA를 제외함으로써 무혈청 배지에 첨가하는 단백질 함량을 최소하할 수 있었고, 이로 인한 세포농도 감소는 없었다. SFLSM은 0.2micron 필터로 여과 멸균하여도 SFLSM의 세포성장효과는 영향을 받지 않는다.
본 연구에서는 참당귀 현탁세포배양에 의한 면역 증강성 ECP의 생산을 증진시키기 위하여 배지교환식 배양을 수행하였으며, ECP의 분비를 촉진하는 초음파 처리와 Pluronic F-68의 영향을 조사하였다. 참당귀의 현탁세포배양시, 최대 세포생장은 6일째에 16.8 g DCW/L였고, ECP의 생산은 세포생장과 함께 증가하다가 8일째에 최고 0.9 g/L가 생산되었다. 식물세포 고농도배양법인 배지교환식 배양을 적용해, 초기 당 농토를 높이고 접종 후 5일부터 연속적으로 배지교환을 해주어 23.8 gDCW/L의 고농도의 현탁세포를 얻을 수 있었다. 초음파 처리 및 Pluronic F-68의 첨가는 참당귀 세포의 세포막의 투과성을 증진시켜 ECP의 생산성을 높임과 동시에 세포 내의 다당의 배지로의 배출을 유도한 것으로 판단된다.
자화수는 물분자의 수소결합에 의한 배열이 특이한 구조를 갖게 됨에 따라 다양한 물리 화학적 성질을 나타낸다. 본 연구에서는 자화수가 계면활성제의 임계미셀농도 (critical micelle concentrations, CMC) 변화에 미치는 영향을 다음과 같이 관찰하였다. $25\;{^{\circ}C}$에서 전도도계(conductivity meter)를 이용하여 음이온 계면활성제인 SDS (sodium dodecyl sulfate)와 양이온 계면활성제인 CTAB (cetyltrimethylammonium bromide)의 CMC를 측정하였고, 표면장력계를 사용하여 SDS와 CTAB 그리고, 비이온 계면활성제인 Pluronic F-68의 CMC를 측정하였다. 또한 Isothermal titration calorimeter (ITC)를 이용하여 $25\;{^{\circ}C}$에서 SDS의 열량변화를 측정하여 CMC의 변화율을 측 정하였다. 결과적으로, 자화수에서 계면활성제의 CMC는 증류수에 비해 현저하게 낮아지는 경 향을 보였는데, SDS는 자화수에서 약 $2.7{\sim}6.5$% 정도 낮아짐을 보였고, CTAB는 자화수에서 약 $2.3{\sim}3.0$% 정도 낮아짐을 보였으며, Pluronic F-68은 자화수에서 약 24.2% 정도 낮아짐을 보였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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