과요오드산으로 산화시킨 당을 유리아미노산과 반응시켜서 ${\alpha}-NH_2$기와 펩티딜리신의 ${\varepsilon}-NH_2$기와 반응하여 결합한 것을 확인하였다. 그래서, 제조한 과요드산-산화당은 단백질 분자 표면의 리신의 ${\varepsilon}-NH_2$기와 Schiff 염기 반응으로 공유결합하여 당단백질을 만드는 것으로 볼 수 있다. 과요드산 산화당으로 변형한 고구마 ${\beta}$-아밀라아제는 C, H는 증가, N은 감소하였다. N말단의 ${\alpha}-NH_2$기는 70% (pentamer), 73% (monomer), ${\varepsilon}-NH_2$기는 33% (pentamer), 26% (monomer)가 산화당과 반응하였다. 페놀-황산법에 의한 총당 정량과 DNP 법으로 분석한 결과, $IO_4$-산화말토헥사오스는 고구마 ${\beta}$-아밀라아제 1몰당 6몰이 결합된 것으로 나타났고, 고구마 ${\beta}$-아밀라아제에 결합된 산화가용성 전분은 효소단백질 대비 13.2% (monomer), 13.5% (pentamer), 산화말토헥사오스는 9.7% (pentamer), 9.3% (monomer)로 나타났다.
과요오드산 산화 가용성전분 및 말토올리고당을 고구마 ${\beta}-amylase$, 밀 ${\beta}-amylase$, aldolase, bovine serum albumin, catalase, carboxypeptidase, ferritin, pronase와 반응시켜서 전기영동하였다. 이들 단백질은 전기영동상의 이동도가 달라지고, 단백질 밴드와 같은 위치에서 PAS 염색 밴드를 나타내어 당이 부가된 것으로 확인되었다. 당의 부가는 과요오드산 산화당의 알데히드기가 단백질 분자 표면 리신의 ${\varepsilon}-NH_2$기와 Schiff 염기를 형성하여 일어난다. 변형효소는 자외흡광곡선에 변화를 나타내지 않았다.
The stabilizatio of amaylolytic enzyme such as $\beta$-amylase of barley, $\beta$-amylase of wheat, $\beta$-amylase of sweet potato, $\alpha$-amylase of Bacillus licheniformis, $\alpha$-amylase of Aspergillus sp. and $\alpha$-glucosidase of Aspergillus awamori was attained by modification with periodate-oxidized soluble starch. The pH stability of modified enzyme was increased at pH 9 for $\beta$-amylase of sweet potato, pH 3~5 and 8~11 for $\beta$-amylase of barley, pH 2~3 and 7~12 for $\beta$-amylase of wheat and pH 6 for $\alpha$-glucosidase of Aspergillus awamori. Thermal stability increased 17.6% for $\alpha$-amylase of Aspergillus sp. at 6$0^{\circ}C$ for 10min, 30% for $\alpha$-amylase of Bacillus licheniformis at 10$0^{\circ}C$ for 5min and 4.5% for $\alpha$-amylase of sweet potato at 6$0^{\circ}C$ for 10min compared with those of native enzymes.
과요오드산-산화가용성전분은 Aspergillus awamori a-glucosidase의 pH 안정성을 증가시켰다. 40℃에서 두시간 항온시킨 결과, 과요오드산-산화가용성전분이 존재하지 않을 때의 효소는 pH 3∼7, 존재할 때의 효소는 pH 3∼9, 50℃에서 과요오드산-산화가용성전분이 존재하지 않을 때의 효소는 pH 3∼6, 존재할 때의 효소는 pH 3∼8 범위에서 안정하였다. 60℃에서는 과요오드산-산화가용성전분의 존재여부에 관계없이 효소는 pH 3∼6 범위에서 안정하였으나 pH 5와 6에서 과요오드산-산화가용성전분이 존재하면 효소의 잔존활성은 존재하지 않을 때보다 20% 더 높았다. 과요오드산으로 변형한 효소는 pH 9에서 활성이 70% 남았으나 변형하지 않은 효소는 남지 않아서 변형으로 안정성이 증가된 것으로 나타났다. 변형효소는 50℃에서 12%, 80℃에서 7%의 활성이 남았으나 변형시키지 않은 효소는 50℃에서 8%가 남고, 70℃이상에서는 남지 않았다. HPLC 분석 결과 pH 2 이하 및 9 이상에서는 효소의 서브유니트가 분리되고, 변성 중합되었다. 변형하지 않은 효소는 산성과 알칼리성 pH에서 변성되어 단백질의 구조가 무너졌지만 과요오드산-산화가용성전분이 존재하면 변성되지 않았다.
Sweet potato $\beta$-amylase is a tetrameric enzyme consisting of four identical polypeptide chains with a molecular weight of 5.6$\times$104, though most of the other $\beta$-amylases are monomeric enzymes. But, the relationship between subunit structure and catalytic function of the enzyme is not known. This study was done to know what the function of the subunit structure of the enzyme is. We obtained the monomer from the enzyme by the treatment of SDS, alkali pH buffer and urea. But the monomer had not activity. We tried to prepare the active monomer from the enzyme by the modification with periodate-oxidized soluble starch , In the result, we succeeded in isolating an active monomer as an oxidized soluble starch-conjugated form The active monomer had 57% of the original activity, 13.2% of the sugar and the molecular weight was estimated to be 5.4$\times$104. This results suggest that the tetrameric form of the enzyme is a most stable one and exists in nature, and the subunit structure of the enzyme Plays an important role in stabilization but not catalytic function.
The stabilization of Aspergillus sp. $\alpha$-amylase was attained by modification with periodate-oxidized sol-uble starch. The pH stability of modified enzyme was increased at pH 3~4 and 9~11 in the presence of $\alpha$-cyclodextrin($\alpha$-CD) compared with that of native enzyme. Thermal stability of the modified enzyme was increased. After treatment at 6$0^{\circ}C$ for 30min the activity remained 20% for the enzyme modified at pH 9.7 in the presence of $\alpha$-CD and tested in the presence of $\alpha$-CD 10% for the enzyme modified at pH 9.7 in the presence of $\alpha$-CD 0% for the native enzyme. The native enzyme and modified enzyme showed one peak in HPLC. The substrate specificity of the modified enzyme was not changed in HPLC analysis of reaction product.
과요오드산-산화전분으로 보리 $\beta$-amylase(Bio-zyme ML, 일본 아마노제약)를 변형시켜서 인공당단백질을 만들었다. pH 8.0에서 변형한 효소는 비변형효소의 92%, pH 9.7에서 변형한 효소는 42%의 활성이 남았다. 6$0^{\circ}C$에서의 열안정성은 $\alpha$-cyclodextrin ( $\alpha$-CD) 존재 시에 변형하여 $\alpha$-CD존재시 분석한 효소는 10분 뒤에 비활성의 8%가 남은 반면 변형하지 않은 효소는 4.5%밖에 남지 않았다. pH안정성은 변형 시켜서 $\alpha$-CD존재 하에 분석한 효소가 가장 높아서 pH 2~5와 7~12에서 안정성이 매우 증가하였다. HPLC분석 결과 효소는 두 개의 피크를 나타냈으며 변형시킨 것은 당결합으로 분자량이 커져서 유출시간이 약간 빨라졌다.
과요오드산-산화전분으로 밀 $\beta$-amylase(Himaltosin GL. 일본한큐바이오사)를 변형시켜서 인공당단백질을 만들었다. pH 8.0에서 변형한 효소는 비변형효소의 96%. pH 9.7에서 변형한 효소는 17%의 활성이 남았다. 6$0^{\circ}C$에서의 열 안정성은 $\alpha$-cyclodextrin ( $\alpha$-CD) 존재 시에 변형하여 $\alpha$-CD 존재시에 분석한 효소는 10분 뒤에 비활성의 8%가 남은 반면 변형하지 않은 효소는 5% 밖에 남지 않았다. pH안정성은 변형시켜서 $\alpha$-CD존재 하에 분석한 효소가 가장 높아서 pH 2~5와 6~12에서 안정성이 매우 증가하였다. HPLC분석 결과 효소는 하나의 피크를 나타냈으며 변형시킨 것은 당결합으로 분자량이 커져서 유출시간이 약간 빨라졌다.
Periodate-oxidized soluble starch was reacted with papain at pH 4.0, pH 7.0, and pH 9.7, and an oxidized soluble starch-papain conjugate was produced. When compared with native papain, the specific activity decreased to 60%, in both the modified papain reacted with 0.4% $NaBH_4$ and in the modified papain not reacted with $NaBH_4$. The specific activity decreased to 70% in the modified papains reacted with 1.5% $NaBH_4$ and 4.0% $NaBH_4$, respectively. The reduction by $NaBH_4$ did not have an effect in the thermal stability of either the modified or nonmodified papain. An activity of 54.7% remained in the papain modified at pH 4.0, which was incubated at $80^{\circ}C$ for 40 min. The papains modified at pH 7.0 and pH 9.7 and incubated for 40 min at two different temperatures, respectively, were stable to $60^{\circ}C$, and at $80^{\circ}C$ their activities at 56.3% and 44.1 %, respectively. The modified papain's thermal stability pattern was similar to that of native papain, with no increase in its statbility. In the range of pH $2.0{\sim}13.0$, the stability of the papain modified at pH 4.0 decreased greatly between pH $3.0{\sim}5.0$, but it was similar to the native papain at other pH values. The stability of the papain modified at pH 7.0 showed a similar pattern to the native papain at pH $2.0{\sim}6.0$, while its stability increased when moving into the alkali pH range. The papain modified at pH 9.7 also had increased stability, when moving into the alkali range. The results of Hammerstein milk casein, which was reacted with the papains modified at pH 4.0, pH 7.0, and pH 9.7, respectively, and analyzed by FPLC, showed different peaks according to the different modification pHs, and the greatest peak differences were observed with the modification at pH 9.7.
NaIO$_4$-산화 전분당을 Bacillus licheniformis의 $\alpha$-아밀라아제의 반응시켜서 시프염기 형성으로 당단백질로 변형시켜서 안정성을 확인하였다. 10$0^{\circ}C$에서의 열안정성은 10분 뒤에, pH 9.7에서 변형한 효소 비변형 효소의 순으로 높았다. 그러나 변형 및 안정성에 $\alpha$-cyclodextrin($\alpha$-CD)을 사용한 결과 큰 차이는 나지 않았다. pH 8.0에서 $\alpha$-CD 존재하에 변형한 효소는 pH 8~11dml 알칼리쪽에서 가장 높은 안정성을 나타냈으나, pH 5~7사이에는 다른 효소보다 낮았다. pH 9.7에서 변형하지 않은 효소는 pH 5부터 pH 13까지 서서히 증가하였고 pH 9.7에서 $\alpha$-CD존재 하의 효소는 pH 5부터 7까지 증가하다가 그 후 pH13까지 서서히 감소하였다. $\alpha$-CD존재하의 비변형 효소는 pH 7과 10에서 피크를나타낸 다음 pH12이후에는 급격히 낮아졌다. 변형한 효소는 HPLC 의 유출시간이 빨라wu서 변형하지 않은 효소보다 분자량이 큰 것으로 나타났다. 분자량 크기는 비변형 효소
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[게시일 2004년 10월 1일]
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