• 한국미생물·생명공학회지
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• 제40권3호
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• pp.186-189
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• 2012

A gene coding for mannanase (manA) from Bacillus subtilis was introduced into a shuttle vector pGK12 between Escherichia coli, B. subtilis and Lactobacillus paracasei. As a result of transferring the resultant plasmid, designated pGK12M3, into three different strains, the manA gene was found to be expressed in L. paracasei as well as in B. subtilis and E. coli. In a 4 L fermentor culture, the production of mannanase by recombinant L. paracasei (pGK12M3) reached a maximum level of 5.4 units/ml in an MRS medium with a fixed pH 6.5. Based on the zymogram of mannanase, it is assumed that mannanase produced by recombinant L. paracasei is not maintained stably with proteolytic degradation. The optimal temperature and thermostability of mannanase produced by recombinant L. paracasei were also found to be different from those of enzymes produced by B. subtilis.

• KSBB Journal
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• 제10권5호
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• pp.575-581
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• 1995

Plasmid pTTY2에 의한 competent cell(P90c/$\phi$ 434)의 형질전환에 의하여 lipase를 생성하는 재조합 대장균(P90c/따434/pTTY2)을 합성하였다. Li pase 활성 조사를 위한 LAT plate, Rhodamine B plate를 이용한 실험에서 P90c/$\phi$434의 경우 halo 형성이 없었고, P90c/$\phi$434/pTTY2의 경우 용해시 켜 얻은 상등액과 용해되지 않은 미생물을 물리적으 로 깨 서 얻은 상등액 모두 halo를 형성하였다. P90c/$\phi$434/pTTY2에 대한 IPTG 유도시점, 유도 시간이 $\phi$434에 의한 미생물 용해에 미치는 영향을 살펴 봄으로써 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 재조합 대장균의 효과적인 용해는 ODGOO 0.5 ~ 2 2.5인 초기 exponential growth phase에서 IPTG 로 유도한 후, mitomycin C 첨가나 uv조사에 의 해 이루어진다. 2. 재조합 대장균의 용해는 IPTG 유도시간이 1 시간일 때 가장 효과적이었으며, 이후 유도시간이 증가할수록 감소하여 유도시간이 4시간일 때는 세포 용해가 이루어지지 않는다. 3. 실험한 범위에서 uv조사보다 mitomycin C 첨가가 세포 용해에 더 효과적이다. 본 연구결과가 대규모의 생물공학 생산물의 정제 에 응용되기 위해서는 고농도 세포에서의 세포용해 에 대한 연구가 펼요한 것으로 판단된다.

• 생명과학회지
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• 제18권11호
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• pp.1592-1599
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• 2008

$\beta$-Lactam계 항생물질에 강한 내성을 가지는 균주 Bacillus sp. J105가 생산하는 $\beta$-lactamase의 유전자를 E. coli DH5$\alpha$에 cloning하였다. Cosmid vector pLAFR3을 이용하여, Sau3AI 으로 부분 분해한 chromosomal DNA와 BamHI으로 처리한 pLAFR3을 ligation하였다. In vitro packaging kit를 사용하여 E. coli에 형질도입 하였으며 $\beta$-lactamase양성 clone주를 획득하였다. 이 recombinant plasmid ($\beta$-lac+)를 pACYC184 (4.2kb) vector를 사용하여 subcloning 하여 최종 $\beta$-lactamase의 활성이 있는 6.4 kb 단편이 포함된 pKL11${\Delta}4.6$을 제작하였다. 이 단편을 DNA 염기서열을 분석한 결과 309개의 아미노산으로 구성된 $\beta$-lactamase를 코딩하는 927 bp를 포함하고 있었다. 클로닝된 $\beta$-lactamase 유전자의 upstream을 포함하는 170 bp의 염기서열을 분석한 결과, B. thuringinesis와 B. cereus 유래의 $\beta$-lactamase 유전자의 upstream 부위와 97%의 일치를 보였다. 본 연구에서 클로닝된 $\beta$-lactamase의 아미노산을 서열을 NCBI BLAST program을 이용하여 분석해 본 결과 B. thuringinesis와 B. cereus의 $\beta$-lactamase와 각각 97%와 94%의 일치를 보였다. 또한 계통도 분석 결과 역시 본 연구에서 클로닝된 $\beta$-lactamase의 아미노산을 서열은 B. thuringinesis와 B. cereus 와 유전학적으로 아주 밀접한 관계를 보여주었다. 이 pKL11-${\Delta}4.6$를 E. coli에서 형질전환 시켜 발현 양상을 조사해 본 결과 $\beta$-lactamase의 secretion efficiency는 약 $4{\sim}5%$％였다. E. coli의 세포 내 단백질로부터 $\beta$-lactamase를 정제하여 분자량을 확인한 결과 31 kDa로 wild type의 분자량과 일치함을 확인하였다.

• 생명과학회지
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• 제29권10호
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• pp.1159-1163
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• 2019

남성호르몬 감소와 관련된 남성갱년기에 대한 관심이 고조되고 있지만, 남성호르몬의 정량을 위해 항체를 이용하는 고가의 kit가 이용되고 있다. 본 연구에서는 in vitro 전사 활성 시험법을 이용하여 남성 스테로이드호르몬의 활성 혹은 농도를 검증하는 시스템을 구축하였다. 테스토스테론-AR (androgen receptor) 복합체와 반응하는 ARE-AdE1bTATA 염기서열이 삽입되고 리포터로 luciferase를 발현하는 테스토스테론 유사활성 검증 리포터 플라스미드인 pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA를 제조하고, 인체 전립선암 세포인 LNcap-LN3 세포에 stable transfection을 실시하였다. 구축된 LNcap-LN3/pGL2-Neo-ARE-AdE1BTATA TCD (testosterone compound detection) 시스템은 표준물질인 테스토스테론의 $10^{-13}{\sim}10^{-8}M$ 범위에서 농도 증가에 비례하는 정량성을 보였다. 이 연구에서 확립된 in vitro TCD 시스템을 이용하면 천연물 유래 테스토스테론 유사물질 및 테스토스테론 저하물질의 대량 탐색 등이 가능할 것이므로, 건강기능성 식품이나 의약품 신소재의 개발에 기여할 것이다.

• Preventive Nutrition and Food Science
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• 제14권1호
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• pp.90-93
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• 2009

Cheonggukjang was prepared from soybean inoculated with B. licheniformis ATCC 10716 cells transformed with pHY3-5 carrying a fibrinolytic enzyme gene. During the 54 hr of fermentation at $37^{\circ}C$, fibrinolytic activities of cheonggukjang were significantly higher than cheonggukjang fermented with B. licheniformis 10716 control cells. The plasmid, pHY3-5 was stably maintained during the 54 hr without antibiotic selection and more than 52% of cells retained the plasmid.

• 생명과학회지
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• 제25권2호
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• pp.158-163
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• 2015

쌀의 쌀눈은 배유에 비해 단백질, 지방, 비타민 B1 등의 영양분을 더 많이 함유하고 있다. 본 연구에서는 식물에서 발현 할 수 있는 p53 플라스미드를 제작하였으며, 여러가지의 배지에서 쌀눈 발아의 최적조건을 확립하였다. p53 플라스미드는 pcDNA-p53 플라스미드에서 p53을 얻어내어 TA 벡터에 subcloning을 한 후 식물 플라스미드인 pGEM-CaMV에 p53을 삽입하여 식물에서 발현 가능한 pGEM-CaMV-p53 플라스미드를 제작하였다. 그리고 효율적인 p53 유전자의 도입을 위하여 최적의 팽윤버퍼의 조성 및 배지의 조건을 확립하였다. 팽윤방법을 통한 유전자의 도입에서 팽윤버퍼는 염과 detergent의 서로 다른 농도로 조성하였지만, 이 버퍼조성 사이에서의 쌀눈 발아율의 유의한 차이는 확인되지 않았다. 또한 팽윤된 쌀눈의 발아를 극대화 시키기 위하여 고체한천배지, 액체 배지, 페이퍼 타올 배지의 3가지 조건에 대해서 발아실험을 진행하였다. 그 결과 고체배지에서의 발아율은 70% 정도로 가장 높고 액체배지에서의 발아율은 20% 정도로 가장 낮았으며, 페이퍼 타올배지에서의 발아율은 60% 정도였다. 앞서 확인한 최적의 발아조건에서 쌀눈에 p53 플라스미드를 도입하였고, 그 결과 쌀눈에서의 human p53 발현을 확인 할 수 있었다. 따라서, 팽윤방법에 의한 쌀눈에서의 효율적인 유전자 발현은 쌀의 새로운 부가가 치를 창출할 수 있을 것이다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제9권3호
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• pp.255-259
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• 1999

A 6.9-kb DNA fragment including the minimal Bacillus pasteurii urease gene cluster was subcloned into a high-copy-number plasmid vector, pUC19, and the recombinant B. pasteurii urease was overexpressed in Escherichia coli. The recombinant urease was purified 25.9-fold by using combinations of anion-exchange and gel-filtration chromatography followed by Mono-Q chromatography on a FPLC. N-terminal peptide sequencing analyses revealed that two distinct smaller peptide bands resolved on a 10-18％ gradient SDS-PAGE corresponded to UreA and UreB peptides, respectively. It was also shown that the ureB gene was translated from a GUG codon and the first methionine residue was post-translationally cleaved off. The native molecular weight of the recombinant urease was 176,000 and 2 nickel atoms were present per catalytic unit. pH stability studies of the purified enzyme showed that the recombinant Bacillus pasteurii urease is stable in alkaline pH range, which is similar to the enzyme of the evolutionarily related bacterium, Sporosarcina ureae.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제47권4호
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• pp.667-672
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• 2019

본 연구는 출아효모 Saccharomyces cerevisiae을 이용해 이종 유전자(heterologous gene)를 효모염색체내에 도입하여 안정적으로 발현하기 위한 시스템의 비교에 대해서 연구하였다. 반복적으로 사용할 수 있는 Cre/loxP system의 이용을 위해 C. glabrata 유래 유전자를 선택마커로 사용하였고, universal pRS-CMT vector를 이용한 4종의 유전자(XYLP, XYLB, GRE3 및 XYL2 유전자)를 모델 유전자로 cloning하였다. 구축된 pRS-XylP, pRS-XylB, pRS-Gre3 및 pRS-Xyl2 plasmid를 이용한 4번의 sequential integration을 통해 효모염색체내에 도입된 4종의 유전자를 순차적으로 발현시킬 수 있었다. 또한 4종의 유전자 발현 cassette를 동시에 가지는 pRS-PBG2 plasmid에 의한 one-step integration을 통해서, 도입될 유전자들의 순서를 정할 수 있었으며 각 유전자들의 동시발현을 안정적으로 유지할 수 있었다. 결론적으로 본 연구에서 사용한 4종의 유전자들의 염색체내 동시 integration 및 발현을 위해서는 one-step integration이 효과적임을 확인하였으며, 적절한 유전자 도입방법을 통해 산업적으로 유용한 생물시스템의 손쉬운 육종이 가능하리라 기대한다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제31권1호
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• pp.25-31
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• 2003

아닐린을 분해할 수 있는 Deiftia acidovoran 51-A가 기존에 분리되어 아닐린 분해능이 우수함이 보고되었다. 이 균주로부터 아닐린 분해관련 유전자를 선발하기 위하여 Tn5-B20삽입 변이체들을 유도하여 영양요구형이 아니면서 아닐린을 분해할 수 없는 변이균주 D. acidovorans 10-4-2 균주를 선발하였다. Southern hybridization 결과 이 변이균주에는 Tn5-B20이 한 copy만 삽입된 것으로 나타났다 이 변이균주의 Tn5-B20삽입의 인접 유전자들을 분리하여 염기서열을 분석한 결과 아닐린 분해의 첫 단계에 해당하는 아닐린의 catechol로의 산화적 deamination에 관련되어 있는 것으로 추정하는 tdnQ, tdnT tdnAl 유전자들이 동정되었고 Tn5-B2O은 tdnAl의 바로 밑에 삽입된 것을 알 수 있었다. TdnA2 및 downstream의 유전자 기능을 상실하여 아닐린을 catechol로 전환하는 과정에 변이가 발생하고 따라서 아닐린을 탄소원으로 이용하지 못하는 표현형을 가지게 된 것으로 결론지을 수 있었다. Tn5-B20 의 일부 DNA 조각을 probe로 Southern hybridization 결과 transposon 삽입이 대형의 플라스미드에 삽입된 것으로 나타나 tdn 유전자들이 pTDN51이라고 명명한 100-kb 이상의 대형 플라스미드에 위치함을 알 수 있었다. 이상의 결과는 D. acidovorans 51-A의 pTDN51상의 tdn유전자들이 아닐린의 분해에 관여함을 보여준다.

• 미생물학회지
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• 제35권3호
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• pp.218-225
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• 1999

Aspergillus nidulans 의 DNA 로부터 Saccharomyces cerevisiae에서 스스로 복제가능하고, 형질전환율도 삽입벡터에 비해 10\sup 4\ 배정도 높여주는 절편을 분리한 바 있다. A. nidulans에서 ANRI 의 일부를 포함한 pILJ16-4.5는 삽입벡터인 pILJ16보다 170배 정도 높은 형질전환 효율을 보였으며, S.cerevisiae와 마찬가지로 plasmid 상태로 회수가능했다. A.nidulans 페소내에서 2-3 copy 정도로 염색체와는 별개로 존재하는 것으로 나타났으며, 재형질전환능력도 있었다. ANRI은 미토콘드리아의 DNA에서 유래한 절편으로 밝고, ARS 공통절편과 유사한 절편도 11곳에 존재한다. $\Phi$X174와 SV40 DNA에서 gyrase 가 결합하는 부위의 공통편인 YRTGNYNNY도 6곳에 존재하며, ColE1에서 gyrase가 결합하는 b site와 일치하는 절편도 하나 포함하고 있으며, ABF1 결합 부위이 공통절편과 유사한 절푠$TCN_7ACG$ 도 하나 포함하고 있다. 이를 토대로 ANRI은 A.nidulans의 형질전환 후 회수가 가능한 replicating vector 개발에 이용할 수 있다.