• 대한소아치과학회지
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• 제24권1호
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• pp.1-17
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• 1997

백서 태자 두개관을 효소처리하여 얻은 조골세포 유사세포군의 증식능 및 골결절의 형성에 미치는 dexamethasone의 영향과 형성된 골결절의 조직학적 형태 관찰을 위하여, 12 well 배양접시의 각 well 당 $4{\times}10^4cell$ 을 접종하였으며, 30일간 표준배양액으로만 배양한 군, 표준배양액에 ascorbic acid와 Na-${\beta}$-glycerophosphate를 첨가한 군, 그리고 각각에 dexa methasone을 첨가한 군등 4군으로 분리 배양하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 골세포의 증식율은 표준용액으로 배양한 군에 비해 dexamethasone 을 단독으로 투여한 군에서 약간 증가하는 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었다 (p<0.05). 2. 골세포의 증식율은 ascorbic acid 에 의해 영향을 많이 받았으며, 특히 ascorbic acid와 dexamethasone을 동시에 투여했을때 더욱 현저히 세포증식율이 감소됨을 볼 수 있었다(p<0.05). 3. 배양 초기에는 세포들이 주로 섬유아세포 양으로 나타났으나, 밀생상태에 이르면서 점차 다각형 형태로 바뀌었다. 4. 배양 9일후 지방세포와 연골세포들이 관찰되었으며, 이들은 모두 dexamethasone이 첨가된 군에서 발견되었다. 5. 골결절은 ascorbic acid와 Na-${\beta}$-glycerophosphate가 첨가된 군에서만 형성되었으며, dexamethasone 을 병용첨가한 군에서 광화된 골결절이 현저히 증가됨을 관찰할 수 있었다. 6. 골결절 형성이 되지 않은 부위의 세포들은 평면형상을 이루고 있었으나, 골결절 부위를 덮고있는 세포들은 많은 세포돌기를 가진 조골세포양 세포들로 나타났으며, ascorbic acid, Na-${\beta}$-glycerophosphate 그리고 dexamethasone 을 첨가한 군에서는 침상의 돌기를 가진 광화물질들이 다발의 교원섬유들 사이에 현저히 많이 존재하였으며, 골결절 내부에는 매몰된 골세포(osteocyte)양 세포들이 관찰되었다.

• Maxillofacial Plastic and Reconstructive Surgery
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• 제32권4호
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• pp.299-305
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• 2010

Purpose: Adipose tissue is located beneath the skin, around internal organs, and in the bone marrow in humans. Its main role is to store energy in the form of fat, although it also cushions and insulates the body. Adipose tissue also has the ability to dynamically expand and shrink throughout the life of an adult. Recently, it has been shown that adipose tissue contains a population of adult multipotent mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells that, in cell culture conditions, have extensive proliferative capacity and are able to differentiate into several lineages, including, osteogenic, chondrogenic, endothelial cells, and myogenic lineages. Materials and Methods: This study focused on endothelial cell culture from the adipose tissue. Adipose tissues were harvested from buccal fat pad during bilateral sagittal split ramus osteotomy for surgical correction of mandibular prognathism. The tissues were treated with 0.075% type I collagenase. The samples were neutralized with DMEM/and centrifuged for 10 min at 2,400 rpm. The pellet was treated with 3 volume of RBC lysis buffer and filtered through a 100 ${\mu}m$ nylon cell strainer. The filtered cells were centrifuged for 10 min at 2,400 rpm. The cells were further cultured in the endothelial cell culture medium (EGM-2, Cambrex, Walkersville, Md., USA) supplemented with 10% fetal bovine serum, human EGF, human VEGF, human insulin-like growth factor-1, human FGF-$\beta$, heparin, ascorbic acid and hydrocortisone at a density of $1{\times}10^5$ cells/well in a 24-well plate. Low positivity of endothelial cell markers, such as CD31 and CD146, was observed during early passage of cells. Results: Increase of CD146 positivity was observed in passage 5 to 7 adipose tissue-derived cells. However, CD44, representative mesenchymal stem cell marker, was also strongly expressed. CD146 sorted adipose tissue-derived cells was cultured using immuno-magnetic beads. Magnetic labeling with 100 ${\mu}l$ microbeads per 108 cells was performed for 30 minutes at $4^{\circ}C$ a using CD146 direct cell isolation kit. Magnetic separation was carried out and a separator under a biological hood. Aliquous of CD146+ sorted cells were evaluated for purity by flow cytometry. Sorted cells were 96.04% positivity for CD146. And then tube formation was examined. These CD146 sorted adipose tissue-derived cells formed tube-like structures on Matrigel. Conclusion: These results suggest that adipose tissue-derived cells are endothelial cells. With the fabrication of the vascularized scaffold construct, novel approaches could be developed to enhance the engineered scaffold by the addition of adipose tissue-derived endothelial cells and periosteal-derived osteoblastic cells to promote bone growth.

• Maxillofacial Plastic and Reconstructive Surgery
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• 제31권4호
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• pp.281-286
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• 2009

Introduction: Enamel matrix derivative (EMD) is a protein which is secreted by Hertwig root sheath and plays a major role in the formation of cementum and attachment of peridontium. Several studies have shown that EMD promoted the proliferation and differentiation of preosteoblasts, osteoblasts and periodontal ligament cells in vitro: however, reports showing the inhibition of osteogenic differentiation by EMD also existed. This study was designed to simultaneously evaluate the effect of EMD on the two cell lines (human mesenchymal stem cells: hMSC, human periodontal ligament derived fibroblasts: hPDLCs) by means of quantitative analysis of some bone related matrices (Alkaline phosphatase : ALP, osteopontin ; OPN, osteocalcin ; OC). Materials and Methods: hMSCs and hPDLCs were expanded and cells in the 4${\sim}$6 passages were adopted to use. hMSc and hPDLCs were cultured during 1,2,7, and 14 days with 0, 50 and 100 ${\mu}g/ml$ of EMD, respectively. ALP activity was assessed by SensoLyte ALP kit and expressed as values of the relative optical density. Among the matrix proteins of the bony tissue, OC and OPN were assessed and quantification of these proteins was evaluated by means of human OC immunoassay kit and human OPN assay kit, respectively. Results: ALP activity maintained without EMD at $1,2^{nd}$ day. The activity increased at $7^{th}$ day but decreased at $14^{th}$ day. EMD increased the activity at $14^{th}$ day in the hPDLCs culture. In the hMSCs, rapid decrease was noted in $7^{th}$ and $14^{th}$ days without regard to EMD concentrations. Regarding the OPN synthesis in hPDLCs, marked decrease of OPN was noted after EMD application. Gradual decrease tendency of OPN was shown over time. In hMSCs, marked decrease of OPN was also noted after EMD application. Overall concentration of OPN was relatively consistent over time than that in hPDLCs. Regarding the OC synthesis, in both of hPDLCs and hMSCs, inhibition of OC formation was noted after EMD application in the early stages but EMD exerted minimal effect at the later stages. Conclusion: In this experimental condition, EMD seemed to play an inhibitory role during the differentiation of hMSCs and hPDLCs in the context of OC and OPN formation. In the periodontium, there are many kinds of cells contributing to the regeneration of oral tissue. EMD enhanced ALP activity in hPDLCs rather than in hMSCs and this may imply that EMD has a positive effect on the differentiation of cementoblasts compared with the effect on hMSCs. The result of our research was consistent with recent studies in which the authors showed the inhibitory effect of EMD in terms of the differentiation of mineral colony forming cells in vitro. This in vitro study may not stand for all the charateristics of EMD; thus, further studies involving many other bone matrices and cellular attachment will be necessary.

• Maxillofacial Plastic and Reconstructive Surgery
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• 제32권3호
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• pp.199-206
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• 2010

This study investigated the effects of strontium on osteoblastic phenotypes of cultured human periostealderived cells. Periosteal tissues were harvested from mandible during surgical extraction of lower impacted third molar. Periosteal-derived cells were introduced into cell culture. After passage 3, the periostealderived cells were further cultured for 28 days in an osteogenic induction DMEM medium supplemented with fetal bovine serum, ascorbic acid 2-phosphate, dexamethasone and at a density of $3{\times}10^4$ cells/well in a 6-well plate. In this culture medium, strontium at different concentrations (1, 5, 10, and 100 ${\mu}g$/mL) was added. The medium was changed every 3 days during the incubation period. We examined the cellular proliferation, histochemical detection and biochemical measurements of alkaline phosphatase (ALP), the RT-PCR analysis for ALP and osteocalcin, and von Kossa staining and calcium contents in the periostealderived cells. Cell proliferation was not associated with the addition of strontium in periosteal-derived cells. The ALP activity in the periosteal-derived cells was higher in 5, 10, and 100 ${\mu}g$/ml strontium-treated cells than in untreated cells at day 14 of culture. Among the strontium-treated cells, the ALP activity was appreciably higher in 100 ${\mu}g$/ml strontium-treated cells than in 5 and 10 ${\mu}g$/ml strontium-treated cells. The levels of ALP and osteocalcin mRNA in the periosteal-derived cells was also higher in strontium-treated cells than in untreated cells at day 14 of culture. Their levels were increased in a dose-dependent manner. Von Kossa-positive mineralization nodules were strongly observed in the 1 ${\mu}g$/ml strontium-treated cells at day 21 and 28 of culture. The calcium content in the periosteal-derived cells was also higher in 1 ${\mu}g$/ml strontium-treated cells at day 28 of culture. These results suggest that low concentration of strontium stimulates the osteoblastic phenotypes of more differentiated periosteal-derived cells, whereas high concentration of strontium stimulates the osteoblastic phenotypes of less differentiated periosteal-derived cells. The effects of strontium on osteoblastic phenotypes of periosteal-derived cells appear to be associated with differentiation-extent.

• Journal of Periodontal and Implant Science
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• 제26권4호
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• pp.779-797
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• 1996

치주 질환에 의해 상실된 치주 조직의 재생과 기능 회복을 위해 골 이식재의 사용을 포함한 많은 치료법들이 이용되었다. 골 이식술을 위해 자가골 이식, 동종골 이식, 이종골 이식, 골 대체 물둥이 이용되어왔다. 이중 탈회 냉동 건조 동종골은 약 20년 전부터 치주 영역에서 사용되어 왔으나 탈회 냉동 건조 동종골의 골내 치주낭 이식의 효과에 대한 연구는 찬반 양론이 대립된다. 탈회 냉동 건조골은 제작 방법 중 특히, 탈회에 의해 탈회 냉동 건조골의 생물학적 성격이 결정되며 이에 따라 치주 조직 재생 능력에도 변화가 있을 수 있다. 이에 본 연구에서는 탈회 시간에 따른 탈회 냉동 건조골 이식이 성견의 3면 골내 치주낭에서 치주 조직 재생에 미치는 영향을 알아보고자 성견의 전치부에 $4mm{\times}4mm{\times}4mm$크기의 3면 골 내낭을 형성한 후 치주 수술만 시행한 군을 대조군으로, 탈회를 시키지 않은 냉동 건조골을 이 식한 군을 실험 I 군으로, 12 시간 탈회시킨 탈회 냉동 건조골을 이식한 군을 실험 n군으로, 24시간 탈회시킨 탈회 냉동 건조골을 이식한 군을 실험 III군으로 설정하여 14주 후에 치유 결과를 조직학적으로 비교 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 결합 조직 유착은 대조군에서 $0.62{\pm}0.14mm$, 실험 I 군에서 $0.42{\pm}0.11mm$, 실험 n군에서 $0.63{\pm}0.43mm$, 실험 III군에서 $0.52{\pm}0.11mm$로 계측되었으며 대조군과 실험군간에 유의성 있는 차이는 없었다. 2. 신생골 형성은 대조군에서 $3.17{\pm}0.24mm$, 실험 I군에서 $3.15{\pm}0.56mm$, 실험 n 군에서 $3.22{\pm}0.36mm$, 실험 III군에서 $3.28{\pm}0.74mm$ 로 계측되었으며 대조군과 실험군간에 유의성 있는 차이는 없었다. 3. 신생 백악질 형성은 대조군에서 $4.19{\pm}0.46mm$, 실험 I군에서 $3.23{\pm}0.64mm$, 실험 II군에서 $4.13{\pm}1.82mm$, 실험 III군에서 $3.13{\pm}0.62mm$로 계측되었으며 대조군과 실험군간에 유의성 있는 차이는 없었다.

• Journal of Periodontal and Implant Science
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• 제34권1호
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• pp.223-241
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• 2004

골재생을 위해 사용되는 골이식재로 자가골, 동종골, 이종골 등이 있다. 자가골은 가장 예지성이 높은 골이식재이지만, 부가적인 수술, 환자의 동통과 불편, 채취하는 양의 제한, 비용의 증가 등의 단점이 있다. 따라서 많은 연구자들은 오랫동안 자가골을 대체할 골이식재 개발에 힘써왔고, 다양한 연구가 있었다. 소로부터 유래한 이종골은 천연 다공성의 골 무기질로서, 인간의 골의 구조와 유사하면서, 골 전도성이 있고, 생체 적합성이 뛰어나다고 보고되었다. 이에 최근에 개발된 Ca-P 박막이 이종골과 조작성을 용이하게 하기 위해 부가적으로 type I collagen을 혼합한 골이식재를 토끼 두개골 결손부에 매식하여 골형성 능력 및 주변 조직의 반응을 보고자 하였다. 총 16마리의 New Zealand white rabbits를 사용하였고, 두개골에 4부위의 결손부를 형성한 후, 다음과 같이 적용하였다. 이식재를 넣지 않은 군을 음성대조군으로, 자가골 분말을 이식한 군을 양성대조군으로, Ca-P 박막 탈단백 우골 분말을 이식한 군을 실험1군으로, Ca-P 박막 탈단백 우골 분말과 type I collagen을 같은 부피로 혼합하여 이식한 군을 실험2군으로 하였다. 1, 2, 4, 8주째 4마리씩 희생하여, H-E 염색과 Masson's trichrome 염색을 시행한 후, 광학현미경을 사용하여 조직학적으로 관찰하였다. 토끼 두개골 결손부에 이식한 Ca-P 박막 탈단백 우골은 골성회복초기에 골결손부 변연에서 골전도성을 보였지만, 완전한 골성회복을 이루지 못하였고, 신생골과 직접적인 유합을 보이지 않았다. 또, collagen의 부가적인 사용은 조작성은 가장 우수했으나, 조직소견상 신생골의 형성을 보이지는 않았다. 반면 자가골을 이식한 부위는 신생골 형성양과 밀도에 있어서 가장 우수한 결과를 보였다.

• Maxillofacial Plastic and Reconstructive Surgery
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• 제29권3호
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• pp.197-205
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• 2007

Angiogenesis is a essential part for bone formation and bone fracture healing. Vascular endothelial growth factor (VEGF), one of the most important molecules among many angiogenic factors, is a specific mitogen for vascular endothelial cells. VEGF-mediated angiogenesis is required for bone formation and repair. However, the effect of VEGF on osteoblastic cells during osteogenesis is still controversial. In recent days, substantial progress have been made toward developing tissue-engineered alternatives to autologous bone grafting for maxillofacial bony defects. Periosteum has received considerable interest as a better source of adult stem cells. Periosteum has the advantage of easy harvest and contains various cell types and progenitor cells that are able to differentiate into a several mesenchymal lineages, including bone. Several studies have reported the bone formation potential of periosteal cells, however, the correlation between VEGF signaling and cultured human periosteal cell-derived osteogenesis has not been fully investigated yet. The purpose of this study was to examine the correlation between VEGF signaling and cultured human periosteal-derived cells osteogenesis. Periosteal tissues of $5\;{\times}\;20\;mm$ were obtained from mandible during surgical extraction of lower impacted third molar from 3 patients. Periosteal-derived cells were introduced into the cell culture and were subcultured once they reached confluence. After passage 3, the periosteal-derived cells were further cultured for 42 days in an osteogenic inductive culture medium containing dexamethasone, ascorbic acid, and ${\beta}-glycerophosphate$. We evaluated the alkaline phosphatase (ALP) activity, the expression of Runx2 and VEGF, alizarin red S staining, and the quantification of osteocalcin and VEGF secretion in the periosteal-derived cells. The ALP activity increased rapidly up to day 14, followed by decrease in activity to day 35. Runx2 was expressed strongly at day 7, followed by decreased expression at day 14, and its expression was not observed thereafter. Both VEGF 165 and VEGF 121 were expressed strongly at day 35 and 42 of culture, particularly during the later stages of differentiation. Alizarin red S-positive nodules were first observed on day 14 and then increased in number during the entire culture period. Osteocalcin and VEGF were first detected in the culture medium on day 14, and their levels increased thereafter in a time-dependent manner. These results suggest that VEGF secretion from cultured human periosteal-derived cells increases along with mineralization process of the extracellular matrix. The level of VEGF secretion from periosteal-derived cells might depend on the extent of osteoblastic differentiation.

• 한국임상수의학회지
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• 제27권4호
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• pp.325-329
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• 2010

본 연구에서는 hydroxyapatite/poly $\varepsilon$-caprolactone composite (HA/PCL) 지지체와 matrigel을 랫드의 두개골 결손부 모델에 함께 이식 시의 골형성 정도를 평가하였다. 두개골결손부는 Sprague Dawley rat (n = 18)에서 수술적으로 형성하였으며 실험군은 Matrigel과 함께 HA/PCL 지지체를 이식한 군(M-HA/PCL group, n = 6)과 HA/PCL 지지체단독이식군(HA/PCL group, n = 6)으로 나누었고 대조군(CD group, n = 6)에는 아무 것도 이식하지 않았다. 수술 4주 후, 골형성은 방사선촬영, micro CT 및 조직검사를 통해 평가되었다. 방사선상에서 CD군의 골형성은 관찰되지 않았으나 HA/PCL과 M-HA/PCL군에서는 관찰되었고 골과 유사한 방사선비투과성이 M-HA/PCL군에서 더 많이 관찰되었다. Micro CT 평가에서 골부피는 HA/PCL군보다 M-HA/PCL군에서 더 높았으나 두 군 사이의 유의적 차이는 관찰할 수 없었다. 그러나 골밀도에서는 HA/PCL군보다 M-HA/PCL군이 더 유의적으로 높음을 확인할 수 있었다(p < 0.05). 조직학적 검사에서는 CD군에서 새로운 골은 원래 존재하던 골로부터만 형성되었으며 두개골결손부 내의 골형성은 보이지 않았다. HA/PCL군에서 새로운 골형성은 원래 존재하던 골로부터만 유래되었으나 M-HA/PCL군은 가장 많은 골형성을 보여주었으며 새로운 골이 원래 존재하던 골과 HA/PCL지지체 주변에서도 관찰되었다. 이러한 결과로 미루어볼 때 HA/PCL 지지체와 matrigel을 함께 사용하는 것이 골의 임계결손부에서 골형성을 증대시키는 효과적인 방법이 될 수 있을 것으로 생각된다.

• Journal of Acupuncture Research
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• 제22권3호
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• pp.215-225
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• 2005

홍화자약침액(紅花子藥鍼液)의 항암효능(抗癌效能)을 밝히고자 간암세포주(肝癌細胞柱)에 최신 oligonucleotide chip assay 법을 통하여 대양(大量)의 유전자(遺傳子) 발현(發顯)을 분석(分析)한 결과(結果) 다음과 같은 결론(結論)을 얻었다. 1. MTT 분석(分析)에서 간암(肝癌) 및 위암세포주(胃癌細胞柱)는 홍화자약침액(紅花子藥鍼液) 1.5, 10, 20m/$m{\ell}$에서 대조군(對照群)에 비해 유의(有意)한 세포활성(細胞活性) 감소(減少)를 보였다. 2. 간암세포주(肝癌細胞柱)에 홍화자약침액(紅花子藥鍼液) 처치(處置) 시(時) 대조군(對照群)에 비해 발현(發顯)이 2배 이상 증가(增加)된 유전자(遺傳子)는 UCIA PMARARA fusion protein, human oral cancer candidate gene mRNA, EPPIN-3 등 19개였다. 3. 간암세포주(肝癌細胞柱)에 홍화자약침액(紅花子藥鍼液) 처치(處置) 시 (時)대조군(對照群)에 비해 유전자(遺傳子)의 발현(發顯)이 2배 이상 감소(減少)된 것은 BTF3, MMP11, paxillin, villinn 등 13개였다. 이상과 같이 홍화자약침액(紅花子藥鍼液)에 대한 간암세포주(肝癌細胞柱)의 유전자(遺傳子) 발현(發顯)을 oligonucleotide 분석(分析)으로 대량(大量) 검소(儉素)할 수 있었고, 심한 발현(發顯) 차이(差異)를 나타내는 각 유전자(遺傳子)는 암화(癌化) 과정(過程)이나, 홍화자약침액(紅花子藥鍼液)에 반응하는 유전자(遺傳子)로 치료제 개발을 위한 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 사료(思料)된다.

• 대한소아치과학회지
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• 제28권2호
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• pp.238-246
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• 2001

본 실험은 탁월한 골유도능으로 관심의 대상이 되고 있는 BMP의 세포내 신호 전달자로 알려진 Smad 1과 Smad 5가 조골세포 초기 분화표지인자인 ALP 유전자의 발현에 미치는 영향 및 그 조절기전을 알아보고자 하였다. BMP 처리 없이도 Smad에 의해 ALP가 발현되는가를 알아보기 위해 Smad 1과 Smad 5가 각각 stably transfection된 C2C12 세포를 3일간 배양후 histochemical assay를 하였고, Smad 1과 Smad 5의 expression vector와 ALP promoter vector를 transient co-transfection한 후 ALP promoter activity를 측정하였다. Smad에 의한 BMP의 효과를 알아보기 위해서 100ng/ml의 BMP-2를 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어 세포를 배양한후 ALP 유전자의 발현을 northern blot analysis로 확인 하였다. Smad가 ALP 유전자의 발현을 직접적으로 조절하는가를 알아보기 위해서는 단백질 합성억제제인 cycloheximide를 전처리하여 ALP 유전자의 발현을 northern blot analysis하였다. 이상의 실험결과 다음과 같은 결론을 얻었다. $\cdot$ Smad 1과 Smad 5가 과발현된 세포에서는 BMP 처리없이도 ALP가 발현된다. $\cdot$ Smad 1과 Smad 5가 과발현된 세포에서 BMP 처리후 ALP 발현 증가율이 대조군 보다 현저히 높게 나타나 Smad가 BMP 효과를 증가시킨다는 것을 알 수 있다. $\cdot$ Smad는 새로운 단백질의 합성을 통해 ALP 유전자를 발현시킨다.