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자폐장애 환자의 세포유전학적 분석 (CYTOGENETIC ANALYSIS OF CHILDREN WITH AUTISM)

  • 정철호;이제영;박영남;박종한;김정범;김재룡;전효진
    • Journal of the Korean Academy of Child and Adolescent Psychiatry
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    • 제5권1호
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    • pp.108-117
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    • 1994
  • 자폐장애와 fragile X증후군의 관련성과 자폐장애 환자에서 특이한 염색체 이상유무를 알고자 자폐장애 환자 29명을 대상으로 하고 질병대조군으로 정신지체 환자 30명을 대상으로 하여, 1) PHA 자극 말초혈 임파구의 G분염에 의한 상용 염색체검사를 실시하여 염색체 이상 유무를 확인하고, 2) MTX를 함유한 배지에서 fragile site 분석을 각각 실시하였다. 연구결과 G 분염에 의한 상용 염색체검사에서는 자폐장애군과 정신지체군에서 모두 46XX 혹은 46XY로서 정상 핵형을 보였으며, fragile site 분석결과에서 fra X(q27.3)은 두 군 모두에서 한 명도 발견되지 않았다. Fragile X 이외의 염색체 이상을 보인 예는 자폐장애군 11명(37.9%), 정신지체군에서 10명(33.3%) 발견되었으나 자폐장애군과 정신지체군 상호간에 유의성 있는 차이는 발견할 수 없었으며, fragile site와 gap이 A, B, C, D, E군에서 다양하게 분포되어 있어 의미있는 분절 부위는 없었다. Fragile site가 관찰된 세포의 수는 자폐장애군에서 31개로 관찰한 모든 중기 세포의 3.6%에 해당하였고 정신지체군에서 29개, 3.2%가 발견되었으며 gap이 관찰된 세포의 수는 자폐장애군에서 43개로 관찰한 모든 중기세포의 4.9%에 해당하였고 정신지체군에서 35개, 3.9%가 발견되었다. 이상의 결과에서, 본 연구에서 조사대상으로 한 자폐장애군에서는 fragile(X)(q27.3)가 한 예에서도 관찰되지 않아, fragile X 증후군에 의한 자폐장애는 매우 드물 것으로 생각되며, fragile X증후군을 자폐장애의 직접적인 원인으로는 생각하기 힘들다. 그리고 자폐장에 환자에서 관찰되는 fragile site와 gap은 정신지체군에서도 비슷한 빈도 및 양상으로 관찰되는 바 자폐장애 환자의 특이한 소견은 아니었다.

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구강 편평세포암종 세포주에서 Cyclosporin A와 Taxol 투여시 PI-3 kinase/Akt1 Pathway에 의한 세포사멸 병용효과 (APOPTOTIC EFFECT IN COMBINATION OF CYCLOSPORIN A AND TAXOL ON ORAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA CELL LINE THROUGH THE PI-3 KINASE/AKT1 PATHWAY)

  • 김규영;이재훈
    • Journal of the Korean Association of Oral and Maxillofacial Surgeons
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    • 제33권5호
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    • pp.426-436
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    • 2007
  • Oral cancer take up 2-6% of all carcinomas and squamous cell carcinoma, which is the most common type in oral cancer, has a poor prognosis due to its high metastasis and recurrence rates. In treating oral cancer, chemotherapy to the primary, metastasized and recurrent lesion is a very important and useful treatment, even though its widespread usage is limited due to high general toxicity and local toxicity to other organs. Taxol, a microtubule stabilizing agent, is an anticancer drug that induces cell apoptosis by inhibiting depolymerization of microtubules in between the metaphase and anaphase of the cell mitosis. Recently, its effectiveness and mechanism on various tumor has been reported. However, not much research has been done on the application of Taxol to oral squamous cell carcinoma. Cyclosporin A, which is an immunosuppressant, is being used on cancers and when co-administered with Taxol, effectiveness of Taxol is enhanced by inhibition of Taxol induced multidrug resistance. In this study, Cyclosporin A with different concentration of Taxol was co-administered to HN22, the oral squamous cell carcinomacell line. To observe the cell apoptosis and the mechanisms that take part in this process, mortality evaluation of tumor cell using wortmannin, c-DNA microarray, RT-PCR analysis, cytometry analysis and western blotting were used, and based upon the observation on the effect and mechanism of the agent, the following results were obtained: 1. The HN22 cell line viability was lowest when $100{\mu}M$ of Wortmannin and $5{\mu}g/ml$ of Taxol were co-administered, showing that Taxol participates in P13K-AKT1 pathway. 2. In c-DNA microarray, where $1{\mu}g/ml$ of cyclosporine A and 3mg/ml of Taxol were co-administered, no up regulation of AKT1, PTEN and BAD c-DNA that participate in cell apoptosis was observed. 3. When $1{\mu}g/ml$ of Cyclosporin A was applied alone to HN22 cell line, no difference was found in AKT1, PTEN and BAD mRNA expression. 4. Increased AKT1, mRNA expression was observed when $3{\mu}g/ml$ of Taxol was applied alone to HN22 cell line. 5. When $1{\mu}g/ml$ of Cyclosporin A and Taxol($3{\mu}g/ml\;and\;5{\mu}g/ml$) were co-administered to HN22 cell line, PTEN mRNA expression increased, whereas AKT1 and BAD mRNA decreased. 6. As a result of cytometry analysis, in the group of Cyclosporin A($1{\mu}g/ml$) and Taxol($3{\mu}g/ml$) co-administration, increased Annxin V was observed, which shows that apoptosis occurred by deformation of plasma membrane. However, no significant difference was observed with vary ing concentration. 7. In western blot analysis, no caspase 3 was observed in the group of Cyclosporin A($1{\mu}g/ml$) and Taxol($3{\mu}g/ml$) co-administration. From the results of this study, it can be concluded that synergistic effect can be observed in combination therapy of Taxol and Cyclosporin A on oral squamous cell carcinoma cell line, where decreased activity of the cell line was observed. This resulted in decreased AKT1 and BAD mRNA and increased PTEN mRNA expression and when wortmannin and Taxol were co-administered, the viability decreased which confirms that Taxol decreases the viability of tumor cell line. Hence, when Taxol and cyclosporine A are co-administered, it can be assumed that cell apoptosis occurs through AKt1 pathway.

난자-난구세포 복합체에서 발현하는 Rpia 유전자의 종 특이적 발현 (Species-specific Expression of Rpia Transcript in Cumulus-oocyte-complex)

  • 김윤선;윤세진;김은영;이경아
    • Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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    • 제34권2호
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    • pp.95-106
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    • 2007
  • 목 적: 본 연구진은 선행연구를 통하여 생쥐의 미성숙 난자와 성숙 난자 사이에 차이 나게 발현하는 유전자(DEGs)의 목록을 보유하고 있는데, 그 중에서 pentose phosphate pathway (PPP)에 필수적 효소인 Ribose 5-phosphate isomerase A (Rpia)를 선택하여 본 연구를 수행하였다. 난자 성숙 과정에 관련된 Rpia의 기능을 알아보기 위한 기초연구로서 생쥐와 돼지의 난소에서 Rpia의 발현을 비교분석 하였다. 연구방법: 생쥐의 각 조직에서 11개의 MII-selective DEGs의 발현을 RT-PCR방법으로 확인하여 난소에서 강하게 발현하는 4개의 유전자를 선택하였고, 다시 이들 4개 유전자 중 난자에서 높게 발현하는 Rpia를 선택하여 생쥐 및 돼지의 난자, 난구세포, 과립세포에서의 발현을 비교분석 하였다. 돼지 Rpia 염기서열은 밝혀져 있지 않아 EST clustering 기법을 통해 동정하였다. 결 과: EST clustering 기법으로 찾아낸 돼지 Rpia 염기서열은 GenBank에 등록하였고 (Accession Number EF213106), 이를 근거로 primer를 작성하여 RT-PCR을 수행하였다. Rpia 유전자는 생쥐에서는 난자 특이적으로 발현하는 반면 돼지에서는 난자, 난구세포, 과립세포에서 모두 발현하는 차이점을 발견하였다. 결 론: 본 연구는 생쥐와 돼지의 난소에서 Rpia유전자 동정에 대한 첫 보고로서, 본 연구결과로부터 생쥐와 돼지의 COCs는 서로 다른 경로로 포도당의 대사가 일어나는 것을 알 수 있었다. 따라서 이와 같은 차이점이 두 종의 난자를 체외 배양할 때 나타나는 난자 성숙률의 차이를 가져오는 기전 중의 하나가 아닐까 추측된다. 난자 성숙을 조절하는 기전을 연구함과 동시에 체외에서 난자 성숙이 어려운 종의 최적의 IVM (in vitro maturation)조건을 찾기 위해서는 앞으로 난자와 주변세포의 포도당 대사과정에 미치는 Rpia의 기능에 대한 후속연구가 필요할 것으로 사료된다.

세포질 내 지방구 제거가 돼지 난포란의 유리화 동결에 미치는 영향 (Study on the Vitrification of Porcine GV and M II Oocytes after Removal of Cytoplasmic Lipid Droplets)

  • 최인경;이승진;송해범
    • 한국수정란이식학회지
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    • 제18권1호
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    • pp.1-14
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    • 2003
  • 본 연구는 미성숙, 성숙 단계의 돼지 난포란이 유리화 동결에 의한 동결보존이 가능한지를 조사 하고자 실시하였다. 난포란은 세포질 내 지방구를 분극시키기 위해 원심분리를 실시하였고, 미세조작기를 이용하여 지방구를 제거하였다. 돼지 난포란을 CB 처리하여 원심분리 후 지방구를 제거한 지방제거구(Delipated), CB 처리 후 원심분리만 하여 지방구를 분극시킨 원심분리구(Centrifuged), 아무처리도 하지 않은 대조구(Control)를 EM grid를 이용한 유리화 동결, 융해 한 후 생존율과 체 외 발생율을 조사하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 미성숙 시기에 지방제거, 원심분리, 무처리 후 유리화 동결을 실시한 돼지 난포란의 생존율은 각각 15.1%, 0%, 0%로 지 방제 거구에서만 유의적으로 높은 생존율을 나타내었다(p<.01). 2. 성숙 시기에 지방제거, 원심분리, 무처리 후 유리화 동결을 실시한 돼지 난포란의 생존율은 각각 12.2%, 0%, 0%로 지방제거구에서만 유의적으로 높은 생존율을 나타내었다(P<.01). 3. 미성숙 시기에 지방제거 후 유리화 동결을 실시하여 생존한 난자치 핵 성숙율은 37.5%로 동결하지 않은 난포란의 성숙율 68.9%보다 유의적으로 낮은 것이었다(P<.01). 4. 미성숙 시기에 지방제거, 원심분리, 무처리 후 유리화 동결을 실시하여 생존한 난자의수정 후 배 발달율은 12.5%, 0%, 0%로 지방 제거구에서만 배 발달을 나타었으나, 세 처리간의 유의차는 없었고, 이것은 동결하지 않은 난포란의 배 발달율 56.1%보다는 유의 적으로 낮은 것이었다(P<.05). 5. 성숙 시기에 지방제거, 원심분리, 무처리 후 유리화 동결을 실시하여 생존한 난자의 수정 후 배 발달율은 25.0%, 0%, 0%로 지방제거구에서만 배 발달을 나타내었으나 세 처리간의 유의차는 없었고, 이것은 동결하지 않은 난포란의 배 발달율 67.9%보다는 유의적으로 낮은 것이었다(P<.05).

돼지 난자의 체외성숙에서 Caffeine 처리가 난자 성숙과 체세포 핵이식 배아의 체외발육에 미치는 영향 (Caffeine treatment during in vitro maturation improves developmental competence of morphologically poor oocytes after somatic cell nuclear transfer in pigs)

  • 이주형;유진영;이한나;신혜지;이근식;이승태;이은송
    • 한국수정란이식학회지
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    • 제32권3호
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    • pp.131-138
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    • 2017
  • 본 연구에서는 체외성숙 배양액 내 caffeine 첨가가 돼지 난자의 성숙과 단위발생 및 체세포 핵이식 후 배 발육에 미치는 영향을 조사하였다. 난세포질 및 난구세포 부착정도의 형태학적 특징에 따라 MGCOCs와 MPCOCs로 구분된 미성숙난자를 각각 무처리군(대조군)과 2.5 mM caffeine이 첨가된 배양액에서 체외성숙 22-42(20시간), 34-42(8시간), 38-42(4시간)동안 처리하는 군으로 나누어 체외성숙을 유도하였다. 또한 체외성숙 난자를 단위발생 및 체세포 핵이식에 공여하여 배아를 생산한 후 7일 동안 체외배양하여 체외성숙 동안 caffeine 처리가 분할률, 배반포 형성률 및 배반포의 세포수에 미치는 영향을 조사하였다. 연구 결과, 분할률 및 배반포 세포 수는 caffeine의 처리 시간에 따라 유의적인 영향을 받지 않았다. 그러나 MPCOCs 유래 난자에서 체외성숙 후기 4시간 동안 caffeine 처리는 체세포 핵이식 배아의 배반포 형성률을 유의적으로 증가시켰다. 이 결과는 caffeine 처리가 체외성숙 동안 난자의 MPF 수준의 감소를 억제시킴으로써 체세포 핵의 리모델링이나 리프로그래밍에 영향을 미쳐 핵이식 배아의 발육능에 영향을 미친 것으로 사료된다.

異種動物의 眼前房에 이식된 濾胞卵子의 成熟에 관한 연구 (Studies on the Maturation of the Follicular Oocytes by Xenoplastical Transplantation in the Anterior Chamber of the Eye)

  • 조완규
    • 한국동물학회지
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    • 제13권3호
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    • pp.68-74
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    • 1970
  • 안전방안에서 여포난자가 성숙한다는 것이 몇가지 동물을 이용한 실험에서 밝혀진 바가 있었거니와 여포 난자가 異種의 안전방내에서도 성숙이 가능한 가를 보기 위하여 본 실험을 행하였다. 토끼의 경우 자체의 안전방내에 이식한 여포난자가 다른 동물 즉 흰쥐나 흰생쥐의 안전방에 이식하였을 때보다 낮은 성숙률을 보여 주고 있을 뿐, 흰쥐, 흰생쥐들은 각각 상호간의 안전방에 이식하였을때 同種의 다른 개체의 안정방에서 얻은 결과보다 훨씬 좋은 성숙률을 나타내고 있다. 특히 흰쥐의 여포난자는 숫컷 흰쥐의 안전방에서 24시간 사이에 76%가 제 1및 제 2차 분렬의 증기에 있으며 같은 종류의 수컷 생쥐의 안전방에서 55%가 성숙한 것 보다 훨씬 높은 율을 보여주고 있는 것이다. 안전방의 전방수가 함유단백질의 양이거나 삼투압에 있어서 일반체액이거나 표준배양액의 것들과는 크게 다르며 세포나 조직의 배양액으로는 그다지 적당한 것으로 보이지 않으나 여포난자의 활성획득에는 큰 영향이 없다할 것이다. 특히 異種간의 이식실험에서 얻은 결과가 자체거나 同種간의 이식실험과 거의 같거나 오히려 더 나은 성과를 보여주고 있는데, 는 그 이유에 대해 더 밝혀야 할 문제로 본다. 단지 난자는 성숙분렬을 위한 활성을 갖는데 난자자체의 구성성분 즉 난황물질의 양에 크게 좌우되는 것같으며 또한 난자가 배양될 안전방의 환경요인이 성숙률을 결정하는 데 큰 영향을 주는 것으로 보인다.

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물리학 선량법을 이용한 갑상선암의 개인별 최대안전용량 I-131 치료법 개발과 유용성 평가 (Development and Assessment Individual Maximum Permissible Dose Method of I-131 Therapy in High Risk Patients with Differentiated Papillary Thyroid Cancer)

  • 김정철;윤정한;범희승;제갈영종;송호천;민정중;정환정;김성민;허영준;이명호;박영규;정준기
    • 대한핵의학회지
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    • 제37권2호
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    • pp.110-119
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    • 2003
  • 목적: 분화갑상선암 환자에 대한 방사성옥소(I-131) 치료는 재발율과 사망률을 감소시키는 효과적인 치료법이지만, 치료용량을 증가시킴으로써 치료율을 향상시킬 수 있는지에 대해서는 아직 논란이 있다. 본 연구에서는 최대허용선량 치료법의 효용성을 검증하고자 하였다. 대상 및 방법: 임상적 병기가 제3, 4병기이고, 6개월 이후에 I-131 전신스캔(이하 IWBS)과 혈중 thyroglobulin (이하 Tg), anti-thyroglobulin antibody (이하 ATA), 초음파검사(이하 US) 및 F-18 FDG PET 등을 통해 치료여부를 확인할 수 있었던 58명(남:여=9:49, 평균연령 $50{\pm}11$세)의 유두상갑상선암 환자를 대상으로 하였다. 이중 11명은 제4병기, 47명은 제3병기였으며, 43명(남:여=4:39, 평균연령 $50{\pm}11$세)은 7.4 GBq 이하의 고식적인 저용량치료법으로 치료하였고, 9.25 GBq 이상의 고용량 치료를 받은 환자는 15명(남:여=5:10, 평균연령 $50{\pm}12$세)으로 고용량군에서 남자가 더 많았으나 연령의 차이는 없었다. 고용량군 환자 모두에서 추적용량의 방사성옥소(평균 $77{\pm}3MBq$)를 경구 투여한 후 혈중 방사능소실곡선을 통해 최대허용선량(maximum permissible dose, 이하 MPD)을 계산하였으며, 7명에서는 말초혈액림프구의 중기염색 체분석법에 의해 생물학적으로 MPD를 계산하였다. 14명에서는 치료용량의 방사성옥소를 투여한 후 혈중 방사능소실곡선을 통해 MPD를 계산하였다. 완전치유(complete response, 이하 CR)는 IWBS에서 병소가 없어지고, 혈중 Tg치가 1 ng/mL 이하로 감소한 경우로 정의하였으며, 부분치유(partial response, 이하 PR)는 IWBS에서 병소가 없어졌더라도 혈중 Tg, ATA치가 높거나, US 또는 PET 검사에서 병소가 남아있는 경우로 정의하였다. 치료후 IWBS에서 병소가 오히려 증가하거나 변함없는 경우는 없었다. 방사성옥소 치료에 의한 부작용은 입원기간 중 타액선이 현저하게 붓고 통증이 있거나, 구토를 심하게 하는 경우, 그리고 퇴원후 1개월째 백혈구수가 20% 이상 감소한 경우로 정의하였다. 결과: 양 군간에 연속적인 수치변화를 비교하는 경우는 paired t-test를 이용하였으며, 대상군간 치료효과와 부작용의 비교는 chi-square test를 이용하였다. p값 0.05 미만을 통계적으로 유의한 차이로 인정하였다. 고용량군 환자 모두에서 추적용량과 치료용량의 방사성옥소 투여 후 혈액의 피폭선량은 각각 $0.012{\pm}0.3Gy,\;1.66{\pm}25Gy$였으며, 방사성옥소 투여 후 혈액에 전달되는 피폭선량은 추적용량보다 치료용량에서 더 많았고(1.21: 166 rad, p<0.0001), 방사성옥소 1 mCi당 혈액에 전달되는 피폭선량은 차이가 없었다($0.58{\pm}0.1\;vs.\;0.56{\pm}0.1$ rad/37 MBq, p=0.34). 추적용량 방사성옥소 투여 후 구한 MPD는 평균 $13.3{\pm}1.9GBq\;(9.7{\sim}16GBq)$ 이였고, 치료용량 방사성옥소 투여 후 구한 MPD는 평균 $13.8{\pm}2.1GBq(10.4{\sim}16.3GBq)$로 유의한 차이가 얻었으며 (p=0.20), 두 수치간에는 유의한 상관 관계가 있었다(r=0.8, p<0.0001). 7명의 환자에서 말초혈액림프구 중기염색체 분석법으로 MPD를 측정하였는데 혈액의 피폭선량은 $1.78{\pm}0.03Gy$였으며, 같은 환자에서 혈중 방사능소실곡선으로부터 구한 피폭선량은 $1.54{\pm}0.03Gy$로 유의하게 낮았으나 (p=0.01), 두 측 정치 간에는 유의한 상관관계(r=0.86, p=0.01)가 있었다. 저용량 치료군 43명 중 22명(51.2%)에서 완전치유를 보였고 21명(48.8%)에서는 부분치유를 보인 반면, 고용량 치료군 15명 중 12명(80%)에서 완전치유를 보였고 3명(20%)에서만 부분치유를 보여 고용량 치료군에서 유의하게 높은 완전치유를 얻을 수 있었다(p=0.05). 한편 부작용 발생빈도는 저용량 치료군 43명 중 13명(30.2%), 고용량 치료군 15명중 6명(40%)로 양군간에 유의한 차이가 없었다(p=0.46). 임상적인 병기, 연령 및 성별에 따라서는 치유의 차이가 없었다(모두 p>0.05). 결론: 혈중소실곡선으로부터 MPD를 결정하고 이를 토대로 환자 개개인별로 적절한 선량을 선택하여 치료하는 방법은 부작용을 최소화하면서도 치료효과를 높일 수 있는 매우 유용한 치료법이며, 고위험군 분화갑상선 암 환자에게 가장 적절한 치료법이라고 사료되었다.

체외성숙 돼지 난포란의 액상정액을 이용한 체외수정 (In Vitro Fertilization of Pig Oocytes Matured In­Vitro by liquid Boar Spermatozoa)

  • 박창식;이영주
    • 한국가축번식학회지
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    • 제26권1호
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    • pp.17-23
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    • 2002
  • 본 연구는 지금까지 돼지 난포란 성숙을 위해서 많이 사용하고 있는 mTCM-199, mWaymouth MB 752/1 그리고 NCSU-23 성숙배지를 비교하고 액상정액을 이용한 체외수정 방법을 개발하고자 실시하였다. 미성숙 난포란은 0.5 $m\ell$의 성숙배지에 각 well 당 30~40개씩 적하하였고, 38.5$^{\circ}C$, 5% CO2, 95% 공기로 조절된 CO2 배양기에서 44시간 성숙 시켰다. 미성숙 난포란을 mTCM-199, mWaymouth MB 752/l 그리고 NCSU-23 성숙배지에서 44시간 배양한 결과 CVBD 발생율은 각각 95.6, 94.1 그리고 94.9%였으며, MH단계까지의 성숙율은 각각 92.5, 90.1 그리고 91.1%였다. 성숙배지별, GVBD 발생율과 MH까지의 성숙율간에 유의성은 인정되지 않았다. 액상정액의 제조용 정액은 90% 이상의 운동성을 가진 농후정자부분을 사용하였으며 정액 채취 후 2시간 동안에 22~24$^{\circ}C$의 실온까지 냉각시켰다.실온까지 냉각한 정액은 BTS 희석액으로 2$\times$$10^{8}$ $m\ell$ 정자농도로 조정하여 100 $m\ell$ 플라스틱병에 30 $m\ell$씩 주입하여 17$^{\circ}C$에서 5일간 보관하였다. 5일 보관 후 운동성이 70% 이상인 정자를 체외수정에 이용하였다. 성숙 후 cumulus cell들이 제거된 성숙난포란은 0.5 $m\ell$의 mTCM-199 또는mTBM 수정배지에 30~40개씩 적하하고, 최종정자농도를 2$\times$$10^{6}$$m\ell$되도록하여 6시간 동안 수정시켰다. 체외수정시킨 수정란들은 0.5 $m\ell$의 NCSU-23 배양배지에서 수정 후 6시간 배양하여 정자침입율, 다정자침입율 그리고 웅성전핵형성율을 조사하였고, 수정 후 45시간 배양하여 난할율을 조사하였다. NC-SU-23 성숙배지와 mTBM 수정배지를 이용하였을때 웅성전핵형성율이 48.0%로써 mTCM-199 성숙배지와 수정배지 또는 mWaymouth MB 752/1 성숙배지와 mTCM-199 수정배지를 이용하였을 때보다 웅성 전핵 형성율이 높았다. 2~4세포기까지의 난할율은 mTCM-199 성숙, 수정 및 배양배지에서 24.1%, mWaymouth 752/1 성숙배지, mTCM-199 수정 및 배양배지에서 43.6%, 그리고 NCSU-23 성숙배지, mTBM 수정배지 및 WCSU-23 배양배지를 이용한 것이 71.2%였다. 이상의 결과를 종합하면 BTS 희석액으로 17$^{\circ}C$에서 5일 보존한 액상정액으로 체외수정이 가능함을 입증하였고, NCSU-23 성숙배지, mTBM 수정배지 및 NCSU-223 배지가 미성숙 난포란의 성숙, 수정 및 배양에 우수한 배지임을 입증하였다.

수핵난자와 전기적 융합조건이 산양의 이종간 복제수정란의 체외발달에 미치는 영향 (Effects of Recipient Oocytes and Electric Stimulation Condition on In Vitro Development of Cloned Embryos after Interspecies Nuclear Transfer with Caprine Somatic Cell)

  • 이명열;박희성
    • Reproductive and Developmental Biology
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    • 제28권1호
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    • pp.21-27
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    • 2004
  • 본 연구는 이종간 핵이식란의 생산성 향상에 기여하기 위한 기초연구로서 핵이식 수정란의 융합과 활성화 과정에 있어서 수핵난자 및 전기적 융합조건이 핵이식 수정란의 융합 및 체외 발달에 미치는 요인들을 조사하기 위하여 실시하였다. 도축되어지는 소 및 돼지의 난소에서 난포란을 채취하여 TCM-199 및 NCSU-23에 혈청 및 호르몬을 첨가하여 39$^{\circ}C$, 5% CO$_2$ 배양기내에서 24 및 48시간 체외성숙을 실시하여 수핵난자를 준비하고, 공여세포의 준비는 산양의 귀세포를 채취하여 0.25% Trypsin-EDTA의 처리로 세포를 분리, 배양하여 사용하였으며, 계대배양과 함께 세포는 TCM-199 + 10% FBS + 10% DMSO로 동결을 실시하였다. 핵이식은 성숙된 난자의 극체 및 전핵을 laser system으로 투명대를 drilling 하여 제거하고 준비된 공여세포를 핵이 제거된 난자에 주입하여 전기적 자극으로 융합을 실시하여 융합된 난자는 전기적 자극으로 활성화를 유도하였다. 활성화가 이루어진 복제 수정란은 수핵란이 소난자의 경우 monolayer가 형성된 10% FBS가 첨가된 TCM199 배양액에서 7∼9일 동안 체외배양하였으며, 수핵란이 돼지의 경우 10% FBS가 첨가된 NCSU-3 배양액으로 6∼8일 동안 체외배양을 실시하여 배반포기로 유도하였다. 본 연구에서 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다. 전기자극의 세기를 1.95 kv/cm와 2.10 kv/cm로 주었을 때 수핵란이 소 난자의 경우 융합율은 47.7및 44.6%였으며, 분할율도 41.9 및 54.5%로써 차이가 없었다. 수핵란이 돼지 난자인 경우는 융합율은 51.3 및 46.1%로써 차이가 없었으며, 분할율도 75.0및 84.9%로써 차이가 없었다. 전기자극 시간을 30 또는 60${\mu}$sec, 횟수는 1 또는 2회 주었을 때 수핵란이 소 난자의 경우 융합율은 30 ${\mu}$sec 1회(50.8%) 와 2회(31.0%) 간에 차이가 없었으나, 60${\mu}$sec 1회(19.3%)가 가장 낮았다(P<0.05). 융합란의 분할율은 30${\mu}$sec 1회(53.3%)와 2회(50.0%) 간에 차이가 없었으나, 60${\mu}$sec 1회(18.2%)보다 유의적(P<0.05)으로 높게 나타났다. 돼지 난자의 경우 융합율은 30${\mu}$sec 1회(48.1%), 2회(45.2%)및 60${\mu}$sec 1회(48.6%)간에 차이가 없었으며, 분할율은 30${\mu}$sec 1회(78.4%)와 60${\mu}$sec 1회 (79.4%)간에 차이가 없었으나, 30${\mu}$sec 2회(53.6%)보다 유의적(P<0.05)으로 높게 나타났다. 이종간 핵이식란의 체외발달에 있어서 수핵란이 소 난자의 경우 상실배와 배반포기로의 발달율이 22.6%로써 단위발생란 30.6%와 차이가 없었으며, 돼지 난자의 경우는 이종간 핵이식란이 5.1%로써 단위발생란 37.4%보다 유의적(P<0.05)으로 낮게 나타났다. 이상의 실험결과로 보아 산양의 체세포를 이용한 이종간 핵이식 복제수정란의 생산을 위하여 수핵란으로 소와 돼지를 사용하여 복제수정란의 발달을 확인할 수 있었으며, 이종간 핵이식에 있어서 수핵란, 공여세포, 융합, 활성화 및 배양조건 등 아직 초보 수준에 있으며, 앞으로 보다 많은 연구를 통하여 이러한 문제들이 해결되면 멸종위기 상태에 있는 동물들의 종 보존에도 활용이 가능할 것으로 생각된다.