• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제13권2호
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• pp.182-190
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• 2003

A new phaC gene cluster encoding polyhydroxyalkanoate (PHA) synthase I PHA depolymerase, and PHA synthase II was cloned using the touchdown PCR method, from medium-chain length (mcl-) PHA-producing strain Pseudomonas putida KT2440. The molecular structure of the cloned phaCl gene was analyzed, and the phylogenic relationship was compared with other phaCl genes cloned from Pseudomonas species. The cloned phaCl gene was expressed in a recombinant E. coli to the similar level of PHA synthase in the parent strain P. putida KT2440, but no significant amount of mcl-PHA was accumulated. The isolated phaCl gene was re-introduced into the parent strain P. putida KT2440 to amplify the PHA synthase I activity, and the recombinant P. purida accumulated mcl-PHA more effectively, increasing from 26.6 to $43.5\%$. The monomer compositions of 3-hydroxylalkanoates in mcl-PHA were also modified significantly in the recombinant P. putida enforcing the cloned phaCl gene.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제32권2호
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• pp.123-127
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• 2004

토양으로부터 oleic acid 를 탄소원으로 이용하여 MCL-PHA의 생산능이 우수한 균주를 분리하여 Pseudomonas sp. MBEL21이라 명명하였다. Pseudomonas sp. MBEL21의 PHA함량을 증가시키기 위하여 여러 가지 필수 영양분의 제한 조건에서 배양한 결과, 인산이 제한된 조건에서 가장 높은 함량의 PHA를 축적하였다. 고농도의 MCL-PHA생산을 위한 Pseudomonas sp. MBEL21의 유가식 배양 전략을 개발하여 28.1 wt％의 함량으로 23 g/L. MCL-PHA를 생산하였다. 또한, 분리된 Pseudomonas sp. MBEL21을 olive oil을 탄소원으로 이용하여 배양한 결과 9.3 wt％의 PHA가 축적되어졌으며, MCL-hydroxyalkanoate와 함께 3-hyoxy-butyrate 의 단량체들로 이루어진 PHA가 확인되어졌다. 이러한 결과들은 분리된 신규 Pseudomonas sp. MBEL21이 저가의 olive oil로부터 생분해성 탄성체의 응용분야를 갖는 MCL-PHA를 효율적으로 생산할 수 있다는 것을 보여준다.

• 미생물학회지
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• 제41권3호
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• pp.225-231
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• 2005

식물유를 탄소원으로 사용하여 medium-chain-length polyhydroxyalkanoates (MCL-PHAs)를 생산할 수 있는 Pseudomonas chlororaphis HS21을 대상으로 대사경로의 변화를 통하여 식물유의 MCL-PHA로의 전환율을 증진시키고 MCL-PHAs의 단위체 조성의 변화를 유도하기 위한 방안을 모색하였다. P. chlororaphis HS21의 MCL-PHAs 생합성은 세포생장과 동시에 일어나는 특징을 보였으며, 팜유를 유일 탄소원으로 사용한 회분배양의 결과 2.4 g/L의 건체량과 건체량의 $40.2\;wt{\%}$에 해당하는 MCL-PHAs를 얻을 수 있었다. 또한 생합성된 MCL-PHAs의 단위체는 3-hydroxyhexanoate($7.0\;mol{\%}$, 3-hydroxyoctanoate ($45.3\;mol{\%}$. 3-hydroxydecanoate ($39.0\;mol{\%}$), 3-hydroxydodecanoate ($6.8\;mol{\%}$) 및 3-hydroxytetradecanoate ($1.9\;mol{\%}$)로 구성되어 있었다. 식물유와는 달리 포도당과 같은 탄수화물은 P. chlororaphis HS21의 생장에는 이용되지만 MCL-PHAs의 생합성에는 거의 이용되지 못하는 탄소원임을 확인하고, 식물유와 함께 포도당을 보조기질로 공급한 결과 식물유의 MCL-PHAs로의 전환율이 크게 증가함으로써, PHA 생산에 직접적으로 이용되지 못하는 보조기질의 사용을 통하여 특정 기능기를 함유하는 기질로부터 해당 기능기를 갖는 MCL-PHAs를 효율적으로 생산할 수 있음을 알 수 있었다. 또한 지방산의 ${\beta}-oxidation$ 회로를 방해하는 아크릴산을 첨가할 경우 아크릴산의 독성에 의하여 세포생장은 저해를 받지만 세포 내 MCL-PHAs의 축적율은 감소하지 않았으며, MCL-PHAs를 구성하는 단위체 중 3-hydroxydo-decanoate 및 3-hydroxytetradecanoate와 같이 탄소수가 보다 큰 단위체의 함량이 크게 증가하였다. 이러한 특징에 의해 해바라기유와 옥수수유로부터는 3-hydroxydodecenoate, 3-hydroxytetradecenoate와 같은 불포화 단위체의 함량이 크게 증가된 기능성 MCL-PHAs를 생산할 수 있었다. 이러한 결과는 아크릴산의 첨가와 같은 PHA 대사경로의 인위적 변화가 새로운 단위체 조성을 갖거나 기능기를 가짐으로써 독특한 물성을 지니는 신규의 MCL-PHAs 개발에 유용할 수 있음을 보여준다.

• KSBB Journal
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• 제19권4호
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• pp.331-334
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• 2004

재조합 E. coli를 이용한 MCL-PHA의 생산에서 fatty acid pathway로부터 PHA 생합성 전구체 물질들이 만들어진다는 사실과 함께 이에 관여하는 enzymes이 밝혀지고 있다. 본 논문에서는 protein homology search로부터 탐색된 paaG와 ydbU genes의 PHA 생합성에서의 역할을 확인하기 위하여 paaG와 ydbU gene이 각각 knock-out된 mutant E. coli strains 를 제작하였다. 제작된 mutant E. coli들은 모균주들보다 낮은 PHA 농도와 함량을 가졌으며, 이러한 결과들로부터 paaG와 ydbU는 fatty acid pathway에서 PHA synthesis의 전구체 물질들을 공급한다는 사실을 확인하였다. 또한, 새로운 FadB homologous enzyme YgfG를 탐색하였으며, ygfG gene이 overexpression된 균주와 ygfG mutant를 제작하여 PHA 합성을 실험한 결과 ygfG도 paaG와 ydbU와 유사한 역할을 한다는 사실을 밝혔다. 이러한 연구결과들은 E. coli에서의 MCL-PHA 단량체들의 합성 경로를 확인하여 효과적인 PHA 생산 균주를 제작할 수 있게 할 것이다.

• Journal of Microbiology
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• 제45권2호
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• pp.87-97
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• 2007

Medium-chain-length polyhydroxyalkanoates (MCL-PHAs), which have constituents with a typical chain length of $C_{6}-C_{14}$, are polyesters that are synthesized and accumulated in a wide variety of Gram-negative bacteria, mainly pseudomonads. These biopolyesters are promising materials for various applications because they have useful mechanical properties and are biodegradable and biocompatible. The versatile metabolic capacity of some Pseudomonas spp. enables them to synthesize MCL-PHAs that contain various functional substituents; these MCL-PHAs are of great interest because these functional groups can improve the physical properties of the polymers, allowing the creation of tailor-made products. Moreover, some functional substituents can be modified by chemical reactions to obtain more useful groups that can extend the potential applications of MCL-PHAs as environmentally friendly polymers and functional biomaterials for use in biomedical fields. Although MCL-PHAs are water-insoluble, hydrophobic polymers, they can be degraded by microorganisms that produce extracellular MCL-PHA depolymerase. MCL-PHA-degraders are relatively uncommon in natural environments and, to date, only a limited number of MCL-PHA depolymerases have been investigated at the molecular level. All known MCL-PHA depolymerases share a highly significant similarity in amino acid sequences, as well as several enzymatic characteristics. This paper reviews recent advances in our knowledge of MCL-PHAs, with particular emphasis on the findings by our research group.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권12호
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• pp.1935-1939
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• 2006

The gene encoding the extracellular medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoate) (MCL-PHA) depolymerase of Pseudomonas luteola Ml3-4, $phaZ_{plu}$, was cloned and analyzed. It was found to be 849 bp, with a deduced protein of 282 amino acids, and was revealed to have a typical leader peptide at its N terminus. The amino acid sequence of $PhaZ_{plu}$ revealed relatively low identity (69 to 72%) with those of other Pseudomonas MCL-PHA depolymerases. In comparison with the amino acid sequences of all available MCL-PHA depolymerases, the depolymerase was found to consist of three domains in sequential order; signal peptide, an N-terminal substrate binding domain, and a catalytic domain, indicating that $PhaZ_{plu}$ belongs to the type IV depolymerases family. The enzyme also contained Asn as an oxyanion hole amino acid.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제17권12호
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• pp.2018-2026
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• 2007

A bacterium, Pseudomonas aeruginosa BM114, capable of accumulating a blend of medium-chain-length (MCL)- and short-chain-length (SCL)-polyhydroxyalkanoic acid (PHA), was isolated. Salicylic acid (SA), without being metabolized, was found to specifically inhibit only the accumulation of MCL-PHA without affecting cell growth. An addition of 20 mM SA selectively inhibited the accumulation of MCL-PHA in decanoate-grown cells by 83% of the control content in one-step cultivation, where overall PHA accumulation was inhibited by only ${\sim}11%$. Typically, the molar monomer-unit ratio of the PHA for 25 mM decanoate-grown cells changed from 46:4:25:25 (=[3-hydroxybutyrate]:[3-hydroxycaproate]: [3-hydroxyoctanoate]:[3-hydroxydecanoate]) at 0 mM SA (dry cell wt, 1.97 g/l; PHA content, 48.6 wt%) to 91:1:4:4 at 20 mM SA (dry cell wt, 1.85 g/l; PHA content, 43.2 wt%). Thus, the stimulation of SCL-PHA accumulation was observed. Growth of P. aeruginosa BM114 on undecanoic acid also produced a PHA blend composed of 47.4% P(3HB-co-3-hydroxyvalerate) and 52.6% P(3-hydroxyheptanoate-co-3-hydroxynonanoate-co-3-hydroxyundecanoate). Similar to the case of even-carboxylic acids, SA inhibited the accumulation of only MCL-PHA, but stimulated the accumulation of SCL-PHA. For all medium-chain fatty acids tested, SA induced a stimulation of SCL-PHA accumulation in the BM114 strain. SA could thus be used to suppress only the formation of MCL-PHA in Pseudomonas spp. accumulating a blend of SCL-PHA and MCL-PHA.

• 미생물학회지
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• 제48권3호
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• pp.200-206
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• 2012

활성슬러지로부터 특이한 조성의 polyhydroxyalkanoates (PHAs)를 생합성하는 Pseudomonas aeruginosa P-5를 분리하였다. 이 균주는 nonanoic acid나 heptanoic acid와 같은 홀수개의 탄소수를 가지는 지방산을 단일 탄소원으로 공급해주었을 경우, 3-hydroxyvalerate (3HV)와 medium-chain-length (MCL) 3-hydroxyalkanoates 단위체로 이루어진 공중합체를 생산하였다. 공중합체 내 3HV의 함량은 valeric acid와 같은 보조기질을 공급함으로써 증가시킬 수 있었으며, 2 g/L nonanoic acid와 1 g/L valeric acid로 이루어진 혼합기질로부터 3HV의 함량이 26 mol%에 달하는 공중합체를 얻을 수 있었다. 이러한 공중합체는 결정성이 매우 낮아 점착성 고분자로서의 성질을 보였다. P. aeruginosa P-5 균주는 MCL-PHA synthase 유전자(phaC1, phaC2)를 가지고 있는 반면에 SCL-PHA synthase 유전자는 결여되어 있는 것으로 나타났다. 따라서 P. aeruginosa P-5 균주의 MCL-PHA synthase는 MCL(R)-3-hydroxyacyl-CoAs 뿐만 아니라 (R)-3-hydroxyvaleryl-CoA를 기질로 인지하는 특이한 기질특이성을 갖는 것으로 사료된다.

• KSBB Journal
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• 제18권2호
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• pp.107-110
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• 2003

스텐트 재질인 stainless steel 표면에 모델 약물인 rose bengal을 포함한 생분해성 고분자 PLGA, PHB, MCL-PHA를 코팅하여 약물방출 특성을 조사하였다. PLGA의 농도가 낮을수록, rose bengal의 농도가 높을수록, dip-coating 시간이 길수록 약물방출이 증가하였으며, PHB > PLGA > MCL-PHA의 순서로 약물이 빨리 방출되었다. 이는 생분해성 고분자의 농도 및 종류, 약물의 농도, dip-coating 시간 등을 변화시켜 약물방출을 조절할 수 있음을 나타낸다.

• 미생물학회지
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• 제36권2호
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• pp.84-90
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• 2000

Psudomonas sp. RY-1이 생성하는 extracellular depolymerase system을 이용하여 단위체의 결가지에 서로 다른 탄소 길이와 불포와기를 함유하는 medium-chain-length polyhdroxyalkanoates (MCL-PHAs)의 생분해도를 시럼실 조건에서 조사하였다. 생분애도는 평파내지에서의 clear zone 형성, 효소 처리에 의한 고분자 현탁액의 탁도 감소 및 호흡량의 경시적 변화로 측정하였다. Pseudomonas sp. RY-1은 MCL-PHA depolymerase의 생성을 통하여 조사된 모든 종류의 MCl-PHAs를 분해할 수 있었으나, 이 효소의 생성은 쉽게 이용될수 있는 이차기질에 의해 저해받는 것으로 나타났다. MCl-PHAs의 분해율이 단위체의 탄소수가 홀수개로 구성된 고분자에 비하여 보다 높았다. 곁가지에 분포화기를 함유한 MCl-PHAs는 불포화기를 갖지 아니하는 고분자에 비하여 분해가 빠르게 이루어졌으며, 이들의 분해는 고분자의 결정화도와 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났다.