• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제55권2호
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• pp.140-153
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• 2003

연구배경 : 결핵균 항원으로 세포 매개성 면역반응이 활성화되면 여러 종류의 cytokine이 분비되고 각기 다른 cytokine과 network system으로 작용하여 여러 병태생리적인 과정을 조절한다. 결핵 환자에서 염증반응, 조직파괴 및 질환의 중증도는 proinflammatory cytokine과 suppressive cytokine의 균형과 조합에 의하여 결정되며, 결핵 진행의 제한과 악화에 중요한 역할을 할 것으로 생각되고 있다. 따라서 결핵의 이환과정에서 cytokine의 분비 및 변화와 역할을 파악하는 것이 질환의 병태생리를 이해하는데 크게 도움이 될 수 있다. 대상 및 방법 : 활동성 폐결핵 83명, 기관지 결핵 10명의 치료전과 정상 대조군 20명에서 말초혈액을 채취하여 혈청을 분리하여 $-70^{\circ}C$에 보관하였고, sandwich ELISA 방법을 이용하여 혈청 IL-$1{\beta}$, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12(p40), TNF-${\alpha}$, IFN-${\gamma}$, TGF-${\beta}$를 측정하였다. 폐결핵 환자 83명을 ATS guideline에 따라 중증도를 분류하였고, 추적관찰 중 탈락자를 제외한 45명에서 초치료 2개월과 6개월 후 각각 혈청 sIL-$1{\beta}$, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12(p40), TNF-${\alpha}$, IFN-${\gamma}$, TGF-${\beta}$를 재측정하였다. 결 과 : 1) IL-$1{\beta}$, TNF-${\alpha}$, IFN-${\gamma}$는 폐결핵 환자에서 대조군에 비하여 증가된 경향을 보였고(p>0.05), IL-6는 폐결핵군에서 통계적으로 유의하게 증가되었다(p<0.05). TGF-${\beta}$는 폐결핵과 기관지 결핵환자에서의 분비가 대조군에 비하여 감소된 경향을 보였으며(p>0.05), IL-2, IL-12(p40), IL-4, IL-10은 대조군과 폐결핵 환자에서 별다른 차이를 보이지 않았다. 2) 기관지 결핵 환자에서 IL-6, TNF-${\alpha}$는 대조군에 비해 증가되고 TGF-${\beta}$는 감소된 경향을 보였다(p>0.05). 폐결핵에 비해 IL-12(p40)의 분비는 증가된 경향을 보였다. 3) 결핵의 중증도가 심할수록 IFN-${\gamma}$와 IL-6가 유의하게 증가하였고(P<0.05), 특히 중증군에서 현저하였다. 4) 폐결핵 환자에서 치료전 측정한 IL-$1{\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$ 간 및 IL-2, IL-4, IL-12 간에는 강한 양의 상관관계를 보였다(p<0.01). 5) 폐결핵 환자 45명에서 측정한 IL-6와 IFN-${\gamma}$는 치료후 2개월과 6개월에 각각 통계적으로 유의하게 감소되었다(p<0.05). 결 론 : 이상의 결과로 결핵의 병태생리에 있어서 여러 cytokine간의 균형과 조합의 변화가 숙주의 염증, 조직파괴 및 결핵의 중증도와 관련되어 있을 것으로 생각되지만 결핵의 형태나 면역반응 정도에 따른 다양성을 보여서 결과의 해석과 cytokine 측정의 임상적 이용에 대한 연구가 더욱 필요할 것으로 사료된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제41권2호
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• pp.87-96
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• 1994

연구배경 : 종양괴사인자(tumor necrosis factor ; TNF)는 여러 암세포에 대해서 세포독성을 보임이 알려져 있다. 그리고, 최근 분자생물학적 발전에 힘입어 TNF 유전자를 암세포에 이입하고 발현시키는 연구가 그 동안 진행되었다. 이들 연구의 목적은, TNF를 전신적으로 쓸 경우 전신 부작용이 심하여 인체에 쓸 수 없는 현 단계에서 암세포 자체에서 TNF를 만들어 내어서 암세포 주위에서만 작용하게 함으로써 연체에 미치는 전신독성을 최소한으로 줄이고 암세포를 사멸시키는 것이었다. 암세포에 TNF 유전자를 이입함으로써 예상되는 항암효과가 성공을 거두기 위해서는 첫째, TNF 유전자가 이입된 암세포에서 분비된 TNF가 주위 암세포를 성공적으로 사멸시켜야 하고 둘째는 분비된 TNF가, TNF 유전자가 이입된 암세포 자신을 사멸시켜야 한다. 본 연구는 이 중 두번째 기전, 즉 TNF 유전자가 이입된 암세포가 자신이 분비한 TNF에 의해서 사멸되거나 또는 세포 독성이 나타날 수 있는가를 검증하는데 목적을 두었다. 방법 : TNF에 감수성을 보이는 인체의 중피종 세포주인 NCI-H2058과 생쥐 섬유육종 세포주인 WEHI164에 TNF-$\alpha$ 유전자를 retroviral vector를 이용하여 이입하고 TNF를 발현을 시도하였다. DNA 수준과 단백질 수준에서 TNF-$\alpha$ 유전자가 제대로 이입되어 발현되는지 PCR과 ELISA 및 bioassay(MTT assay)로 확인하였다. 그리고, TNF 유전자가 이입된 세포주가 자신이 분비하는 TNF에 사멸되는지 아니면 생존하는지 MTT(dimethylthiazolyl diphenyltetrazolium) assay로 알아보았다. 그리고, 만일 TNF 유전자가 이입된 암세포가 자신이 분비한 TNF에 사멸되지 않고 생존할 경우, TNF 유전자가 이입된 NCI-H2058-TNF와 WEHI164-TNF 암세포주가 외부에서 준 TNF에도 내성을 보이는지도 추가로 MTT assay 방법으로 확인해 보았다. 결과 : 1) TNF-$\alpha$ 유전자 이입 및 발현 확인 PCR을 시행한 결과, TNF 유전자가 이입된 NCI-H2058-TNF와 WEHI164-TNF 세포주는 790 base pair 크기의 진한 DNA band를 보인 반면 각각의 모세포주에서는 보이지 않아서 retroviral vector를 이용한 유전자 이입이 DNA 수준에서 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 그리고, NCI-H2058-TNF와 WEHI164-TNF의 상층 배양액의 TNF양을 ELISA와 bioassay(MTT assay)로 측정한 결과, 생물학적 활성을 지닌 TNF를 각각 $23.6{\pm}0.84ng$/24h/$10^6cells$, $12.2{\pm}0.36ng$/24h/$10^6cells$ 생산함을 알 수 있었다. 2) TNF 유전자 이입 전후, 암세포의 TNF에 대한 감수성 비교 TNF 유전자 이입 전후의 TNF에 대한 세포주의 감수성(세포사망율)을 TNF의 농도 변화에 따라 비교한 결과, NCI-H2058의 경우 TNF 농도 100ng/ml에서 모세포는 $25{\pm}3%$의 세포독성을 보인 반면 TNF 유전자 이입 후에는 $3{\pm}2%$의 세포독성을 보여 통계적으로 유의한 차이가 있었다(p<0.01). 그리고, WEHI-164의 경우도 TNF 농도 100ng/ml에서 모세포는 $73{\pm}5%$의 세포독성을 보인 반면 TNF 유전자 이입 후에는 $3{\pm}2%$의 세포독성을 보여 통계적으로 유의한 차이가 있었다(p<0.01). 결론 : TNF에 감수성을 보이는 암세포주인 NCI-H2058과 WEHI164에 TNF 유전자 이입을 시행하고 TNF가 발현되게 하였을 때, TNF 유전자를 이입받은 두 암세포주 모두에서 자신이 생산해 내는 TNF에 내성을 보여 생존하였다. 뿐만 아니라 생존한 이들 세포는 외부에서 준 TNF에 대해서도 내성을 보였다. 따라서, 암세포에 대한 TNF 유전자 이입을 통한 유전자 요법이 성공을 거두려면 유전자 이입된 세포에서 분비하는 TNF의 면역 세포 동원 방법 등의 간접적인 항암기전이 필요할 것으로 생각된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제55권5호
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• pp.449-458
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• 2003

연구배경 : 말초혈액에서 림프구감소증이 있거나(< $1,000/mm^3$) $T_4$-세포의 수가 $500/mm^3$ 이하인 경우, 중증폐결핵의 좋지 않은 예후를 나타내는 것으로 알려져 있다. 하지만 중증폐결핵에서 어떠한 기전으로 말초혈액의 림프구감소증이 발생되는 지는 아직 알려진 바 없다. 이에 연구자들은 말초혈액의 림프구감소증이 골수에서 림프구의 생성 및 분화 또는 순환 중에서 어떠한 단계의 이상으로 발생하는지 알아보고자 골수 소견을 관찰해 보았다. 방 법 : 1999년 8월부터 2002년 8월 사이에 가천의대 길병원에 내원한 중증폐결핵 환자들을 대상으로 하였다(FAPTB군). 65세 이상의 환자, 전신 상태가 안좋은 환자나 쇼크, 혈액학적 질환이 있는 환자는 대상에서 제외하였다. 대조군은 골수침범이나 골수에 영향을 미치지 않는 질환자들을 대상으로 하였다. 각군에서 말초혈액과 골수의 세포 분획을 분석하였고, 골수에서 IL-2, IL-7, IL-l0, TNF-${\alpha}$, IFN-${\gamma}$, TGF-${\beta}$를 측정하였다. 결 과 : 총 13명의 환자가 대상이 되었으며(M:F=9:4) 평균 연령은 $42{\pm}12$ 세였다 말초혈액에서 림프구 분획과 수는 FAPTB 군에서 의미 있게 감소되었다($7.4{\pm}3.0%$, $694{\pm}255/mm^3$ vs. $17.5{\pm}5.8%$, $1,377{\pm}436/mm^3$, 각각 p:0.0001, 0.002). 골수에서의 림프구 분획은 FAPTB군이 대조군 보다 적은 경향을 보였으나 통계적 의미는 관찰되지 않았다($9{\pm}4%$ vs. $12{\pm}3%$, p:0.l38). 골수의 IL-2 농도는 FAPTB군에서 의미 있게 낮게 관찰되었고($26.0{\pm}29.1$ vs. $112.2{\pm}42.4pg/mL$, p:0.001). IL-10도 FAPTB군에서 의미 있게 낮았다($3.4{\pm}4.7$ vs. $12.0{\pm}8.0pg/mL$, p:0.031. IL-7, TNF-${\alpha}$, IFN-${\gamma}$, TGF-${\beta}$ 농도는 두 군간에 의미 있는 차이를 보이지 않았다. 결 론 : 이상의 결과로 진행성 폐결핵 환자에서 말초혈액의 림프구감소증은 골수에서의 이상 소견과 연관이 있으리라고 추정되며, 이에는 IL-2와 IL-10이 관련되어 있을 것으로 생각되나, 향후 립프구감소증 기전의 연구가 더 필요하리라 사료된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제45권2호
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• pp.301-310
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• 1998

연구배경: 결핵성 흉막염은 면학적으로 흉강내에 국소적으로 활성화된 CD4+ T림프구와 대식세포가 관여하는 세포매개면역이 중요한 역할을 하며 이들의 상호작용은 다양한 사이토카인에 의해 좌우된다고 알려져 있다. 특히 helper T cell type 1 (Th1) 사이토카인인 IL-12 및 IFN-$\gamma$와 Th2 사이토카인인 IL-4 및 IL-10간의 균형이 세포매개반응의 정도를 결정한다고 생각되고 있다. 본 연구는 세포매개면역반응의 지표로서 Th1 사이토카인인 IL-12, IFN-$\gamma$와 이들과 길항적으로 작용한다고 알려져있는 Th2 사이토카인 중 IL-10이 결핵성 흉수내에 어떻게 표현되는지를 검사하여 대조군인 악성 흉수와 비교함으로써 결핵성 흉막염의 변역학적 기전을 이해하는데 도움이 되고자 하였으며 아울러 사이토카인의 진단적 유용성을 알아보고자 하였다. 방 법: 각 20명의 결핵성 흉막염과 악성 흉막염 환자를 대상으로 흉수와 혈장에서 IL-10, IL-12, IFN-$\gamma$를 측정하고 흉수에서의 ADA를 측정하여 비교하였다. 사이토카인은 대상환자의 혈액과 흉수를 원심분리하여 얻은 상층액을 ELISA 방법으로 측정하였고 ADA 활성도는 비색법으로 측정하였다. 결 과: 결핵성 흉막염 환자에서 흉수의 IL-10, IL-12, IFN-$\gamma$의 농도는 $121.3{\pm}83.7$ pg/mL, $571.4{\pm}472.7$ pg/mL, $420.4{\pm}285.9$ pg/mL로 혈장의 $21.2{\pm}60.9$ pg/mL, $194.5{\pm}67.6$ pg/mL, $30.1{\pm}18.3$ pg/mL 보다 모두 유의하게 높았다 (p<0.01). 악성 흉막염 환자에서 흉수의 IL-10, IL-12, IFN-$\gamma$의 농도는 $88.4{\pm}40.4$ pg/mL, $306.5{\pm}271.1$ pg/mL, $30.5{\pm}54.8$ pg/mL로 혈장의 $43.4 {\pm}67.2$ pg/mL, $206.8{\pm}160.6$ pg/mL, $14.6{\pm}3.3$ pg/mL와 비교하였을때 IL-10 만이 유의하게 높았고 (p<0.001) IL12, IFN-$\gamma$에선 유의한 차이가 없었다. 결핵성 흉막염과 악성 흉막염 환자의 흉수에서의 농도를 비교하였을 때 IL-12, IFN-$\gamma$, ADA는 결핵성 흉막염에서 유의하게 높았으나 (p=0.046, <0.001, <0.001) IL-10은 유의한 차이가 없었다. 결핵성 흉수염을 악성 흉수염과 감별하는데 있어 IL-12, IFN-$\gamma$, ADA의 기준을 각각 300 pg/mL, 100 pg/mL, 45 U/L으로 하였을때 민감도/특이도는 IL-12에서 60%/70%, IFN-$\gamma$에서 90%/85%, ADA 에서 85%/90%였다. 결 론: 결핵성 흉수에서 흉강내에 Th1 사이토카인인 IL-12, IFN-$\gamma$와 함께 IL-10이 증가되어 있었고 악성흉수와 비교했을때 IL-12, IFN-$\gamma$는 유의하게 증가되어 있었으나 IL-10은 의의가 없었다. 따라서 결핵성 흉막염의 면역기전에 Th1 경로의 세포매개변역반응이 주로 관여함을 확인할 수 있었고 국소적인 IL-10 증가의 임상적 의의는 추후의 연구가 필요할 것으로 생각된다. 또한 IFN-$\gamma$와 ADA는 결핵성 흉수와 악성 흉수와의 감별에 유용한 진단법으로 생각된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제44권4호
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• pp.729-741
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• 1997

연구배경 : 저자들은 최근 결핵균의 자극에 의해 peripheral blood monocytes (PBM)에서 IL-$1{\beta}$와 $TNF{\alpha}$가 생성되고, 기도상피세포에서는 IL-8과 RANTES와 같은 chemokine이 생성된다는 사실을 밝힌 바 있다. 이와같은 사실은 기도상피세포가 IL-8과 RANTES와 같은 chemokine을 분비함으로써 결핵의 병인에 능동적으로 참여함을 시사한다고 하겠다. 기도상피세포에서 발현하는 chemokine들이 결핵의 병태생리에 관여한다면, 폐결핵을 일으키는 가진 균주인 H37Rv와 폐결핵을 일으키지 않는 균주인 H37Ra로 자극하였을때 기도상피세포에서 분비되는 chemokine의 성상이 다를 것이라는 가정이 가능하다. 실제로 독성을 가지고 있는 Erdman 균주와 독성을 가지고 있지 않는 H37Ra의 lipoarabinomannan(LAM) 의 구조가 다르고, 이 LAM으로 대식세포를 자극하였을때 H37Ra LAM은 대식세포에서 $TNF{\alpha}$를 생성시키지만 H37Rv LAM은 $TNF{\alpha}$를 생성시키지 못하고 이와같은 차이가 결핵균에 대한 생체의 방어기전을 설명한다는 보고가 있다. 본 연구는 폐결핵의 병태생리에서 기도상피세포의 역할을 규명하고자, 독성이 있는 균주인 H37Rv와 독성이 없는 균주인 H37Ra를 사용하여 결핵균의 독성여부에 따른 기도상피세포에서 분비되는 chemokine의 차이를 연구하고자 하였다. 방 법 : 정상인에서 채취한 말초혈액에서 말초혈액 단핵세포(PBM)를 분리하여, sonicated H37Rv, H37Ra($5{\times}10^5$ bacilli, A TCC) 또는 LPS($10{\mu}l/ml$)로 자극하면서 24시간 동안 배양하였다. 또한 PBM에 대한 interferon gamma($IFN{\gamma}$)의 영향을 평가하고자 PBM를 결핵균으로 자극하기 한 시간전에 $IFN{\gamma}$(10ng/ml, R & D) 로 전처치한 군과 $IFN{\gamma}$ 전처치 없이 자극한 군을 두었다. 24시간후 상층액을 채취하여 상층액의 일부는 $-70^{\circ}C$에서 보관하였고 이후 ELISA kit(R & D)를 이용하여 $TNF{\alpha}$와 $IL-1{\beta}$의 농도를 측정하였다. 배양된 PBM의 상충액(1 : 2 희석액 )으로 배양된 A549 세포를 다시 자극하면서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양후, 상층액은 IL-8, RANTES의 측정을 위하여 $-70^{\circ}C$에서 보관하고, 남아있는 A549 세포에서 tRNA를 추출하였다. 배양 상층액에서는 ELISA kit(R & D)를 이용하여 IL-8, RANTES의 농도를 측정하였고, 추출한 tRNA는 Northern blot analysis를 이용하여 IL-8, RANTES의 mRNA의 양을 측정 정량하였다. 결 과 : 말초혈액 단핵세포를 LPS, H37Rv, 또는 H37Ra로 자극하였을 때 대조군에 바하여 $TNF{\alpha}$와 IL-$1{\beta}$의 생성이 읖미 있게 증가하였다. 독성이 없는 H37Ra로 자극하였을 때가 독성이 있는 H37Rv로 자극하였을 때보다 $TNF{\alpha}$와 IL-$1{\beta}$의 생성이 많았으나 통계적인 유의성은 없었다. $IFN{\gamma}$로 전처치하였을 때 $TNF{\alpha}$와 IL-$1{\beta}$의 생성이 전처치하지 않은 군에 비해 증가하였으나 H37Rv군과 H37Ra군 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었다. A549 세포를 결핵균이나 LPS로 자극한 말초혈액 단핵세포 배양액으로 자극하였을 때, RANTES와 IL-8 의 유전자 발현이 대조군에 비하여 의미있게 증가하였다(p<0.001). 또한 H37Ra 배양액으로 자극한 군에서 H37Rv 배양액으로 자극한 군에 비하여 RANTES와 IL-8의 유전자 발현이 의미있게 증가하였다 (p<0.05). A549 세포를 결핵균이나 LPS로 자극한 말초혈액 단핵세포 배양액으로 자극하였을 때 RANTES와 IL-8의 생성이 대조군에 비하여 의미있게 증가하였다. 그러나 유전자 발현과는 달리, H37Ra 배양액으로 자극한 군에서 H37Rv 배양액으로 자극한 군에 비하여 RANTES와 IL-8의 생성이 증가하였지만 통계적인 유의성은 없었다. 결 론 : 기도상피세포는 폐결핵에서 RANTES와 IL-8과 같은 강력한 chemokine을 분비하여 염증반응을 증폭시킴으로써 폐결핵의 병인에 능동적으로 참여함을 추정할 수 있었다. 그러나 말초혈액 단핵세포에서의 $TNF{\alpha}$와 IL-$1{\beta}$의 생성은 결핵균주의 독성여부에 따라 차이가 없었고, A549 세포에서도 RANTES와 IL-8의 유전자 발현은 H37Ra 에서 유의하게 증가하였으나 RANTES와 IL-8의 생성은 유의한 차이가 없어 결핵균의 독성 여부가 균주에 따른 생체의 면역반응즉 chemokine 생성의 차이 때문이라는 본 연구의 가설을 증명할 수는 없었다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제45권6호
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• pp.1265-1276
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• 1998

연구배경 : NO는 생체내에서 생성되는 유리 반응기로서 혈관 긴장도외 완화, 혈소판 응집 저지, 혈관 내피세포에 대한 백혈구 유착 방해, 감염에 대한 숙주 방어 등에서 중요한 역할을 한다. NO는 전이 금속(transition metal), 산소, 기타 반응기 등과 쉽게 반응하므로 여러 생체내 반응에 관여하여 산화제 손상을 촉진시키거나 감소시킬 가능성이 제기되었다. 급성 폐손상 및 급성 호흡곤란 증후군에서는 폐혈관 내피세포 및 호중구의 상호작용 및 산화제 손상이 매우 중요한 병인으로 알려져 있으며, NO를 급성 호흡곤란 증후군에서 흡입하여 치료하는 것은 산화제에 의한 혈관 내피세포 손상에서 외부로부터 NO를 공급하는 상황이다. 본 연구에서는 외인성 NO의 공여나 내인성 NO 억제가 산화제에 의한 폐미세혈관 내피세포의 손상을 악화시키거나 완화시킬 수 있는지를 관찰하였다. 방 법 : 산화제에 의한 세포손상은 백서 폐미세혈관 내피세포에 과산화수소를 생성하는 glucose oxidase(GO)를 투여하여 야기시키고 이를 $^{51}Cr$ 방출 측정으로 평가하였다. 산화제에 의한 폐혈관 내피세포의 손상에 외인성 NO가 미치는 영향은 NO 공여물인 SNAP 혹은 SNP를 산화제와 동시에 투여하여 평가하였다. 산화제에 의한 폐혈관 내피세포의 손상에 내인성 NO 억제가 미치는 영향은 NOS 길항제인 L-NMMA을 추가로 투여하여 평가하였다. INF-$\gamma$, TNF-$\alpha$ LPS 등으로 내인성 NO 생성을 자극한 후 L-NMMA의 효과도 관찰하였으며, NO 공여물이나 내피세포로 부터의 NO생성은 nitrite 측정으로 평가하였다. 결 과 : 백서 폐 미세혈관 내피세포에서 $^{51}Cr$ 방출이 GO 5mU/ml에서 $8.7{\pm}0.5%$, 10 mU/ml에서 $14.4{\pm}2.9%$, 15 mU/ml에서 $32.3{\pm}2.9%$, 20 mU/ml에서 $55.5{\pm}0.3%$. 30 mU/ml에서 $67.8{\pm}0.9%$로 GO 15 mU/ml 이상에서 대조군의 $9.6{\pm}0.7%$에 비하여 유의하게 증가하였으며 (P<0.05; n=6). 이에 0.5mM L-NMMA를 추가하여도 영향이 없었다. INF-$\gamma$ 500 U/ml, TNF-$\alpha$ 150 U/ml, LPS 1 ${\mu}g/ml$을 배양액에 첨가하여 24시간 경과시 배양액 중 nitrite 농도가 $3.9{\pm}0.3\;{\mu}M$로 증가하였으며, 이에 L-NMMA 0.5 mM을 첨가하면 $0.2{\pm}0.l\;{\mu}M$로 유의하게 억제되었다(p<0.05 ; n=6). INF-$\gamma$, TNF-$\alpha$ LPS 자극후 GO에 의한 $^{51}Cr$ 방출에 L-NMMA는 영향을 주지 않았다. GO 20 mU/ml에 의한 $^{51}Cr$ 방출이 SNAP 100 ${\mu}M$의 추가로 대조군 수준으로 현저히 억제되었으나, SNP, potassium ferrocyanide, potassium ferricyanide 등의 추가는 영향이 없었다. Hanks' balanced salt solution(HBSS) 중의 SNAP 100 ${\mu}M$로 부터 4 시간 동안 nitrite가 $23.0{\pm}1.0\;{\mu}M$ 농도로 축적되었으나, SNP는 1 mM에서도 nitrite가 검출되지 않았다. SNAP은 HBSS 중의 GO가 과산화수소를 시간 경과에 따라 생성하는데 영향이 없었다. 결 론 : 결론적으로 폐미세혈관 내피세포에서 GO에 의하여 생성되는 과산화수소로 산화제 손상을 야기하였으며, NO 공여물인 SNAP으로부터 제공된 외연성 NO가 산화제 손상을 방지하고 이 보호효과는 NO 방출 능력에 의할 가능성이 시사되었다. 따라서 생체내 환경에 따라 외인성 NO가 내피세포에 대한 산화제 손상에 보호 효과가 있을 수 있다고 추정된다.

• 대한한방종양학회지
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• 제4권1호
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• pp.37-53
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• 1998

과학기술(科學技術)의 발전(發展)에 따른 생활(生活) 및 의료(醫療) 수준의 향상(向上)에도 불구하고 산업발전(産業發展)에 따른 환경오염(環境汚染), 스트레스 증가(增加) 등 그 역기능(逆機能) 때문에 발암물질(發癌物質) 또는 자극(刺戟)에의 노출(露出) 등으로 인해서 전세계적(全世界的)으로 암(癌)으로 인(因)한 사망율(死亡率)이 증가(增加)되고 있다. 암(癌)은 현재(現在) 인류(人類)의 건강(健康)을 위협하는 주요(主要)한 질환(疾患)의 하나로, 오늘날 우리 나라에서 질환(疾患)으로 인(因)한 사망원인중(死亡原因中) 수위(首位)를 차지하고 있다. 이러한 암(癌)의 발생(發生)은 80%-90%가 환경적(環境的) 인자(因子)에 기인(起因)한다고 보고(報告)되고 있는데 앞으로 환경성(環境性) 발암물질(發癌物質)이 점차 증가(增加)됨에 따라 암환자(癌患者)의 발생(發生)도 더욱 증가(增加)될 것으로 예상(豫想)된다. 암(癌)의 서의학적(西醫學的) 치료(治療)는 주로 수술요법(手術療法), 방사선요법(放射線療法), 화학요법(化學療法) 및 면역요법(免疫療法) 등이 활용(活用)되고 있다. 이중 수술요법(手術療法)과 방사선요법(放射線療法)은 암(癌)이 전신(全身)에 전이(轉移) 증식(增殖)되기 전에 실시(實施)함으로써 효과(效果)를 거둘 수는 있으나, 암(癌)이 원발병소(原發病巢) 이외(以外)에까지 전이(轉移) 증식(增殖)되었을 경우에는 이 두가지 방법(方法)의 국소요법(局所療法)만으로서는 좋은 치료효과(治療效果)를 거두기 어렵다. 따라서 최근 항암제(抗癌劑)에 의한 화학요법(化學療法)이 다른 방법(方法)보다 유효(有效)하다고 인정(認定)이 되어 가장 많이 활용(活用)되고 있으나, 암종(癌種)에 대한 감수성차이(感受性差異), 치료후(治療後)의 부작용(副作用), 재발(再發) 및 합병증(合倂症) 등의 문제점(問題點)때문에 부작용(副作用)을 감소(減少)시키면서 항암효과(抗癌效果)를 높이는 치료법(治療法)이 계속 연구(硏究)되고 있다. 이에 1972년(年) 미국(美國) 국립암연구소(國立癌硏究所)에서 실시(實施)한 항암제(抗癌劑) 개발연구(開發硏究)에 있어서 항종양성(抗腫瘍性) Screening test에 이용(利用)된 물질중(物質中) 약 47%가 천연물질(天然物質)이었다는 사실은 주목(注目)할만 하다. 한의학적(韓醫學的) 치료법(治療法)은 최근(最近)에 변증시치(辨證施治)를 근간(根幹)으로 하여 건비익기(健脾益氣)를 위주(爲主)로한 부정거사법(扶正祛邪法)과 부정배본법(扶正培本法)이 많이 활용(活用)되고 있으며 부정법(扶正法)으로는 익기건비(益氣健脾), 자음보혈(滋陰補血), 온보비신(溫補裨腎) 등이, 거사법(祛邪法)으로는 활혈거어법(活血祛瘀法), 청열해독법(淸熱解毒法), 연견화담법(軟堅化痰法) 등이 활용(活用)되고 있는데, 이를 근거(根據)로 하여 한약(韓藥)의 복방(複方).단미(單味).단미추출물(單味抽出物) 등의 투여(投與)와 침(鍼) 구(灸) 수침(水鍼) 전침(電鍼) laser침(鍼)등의 치료방법(治療方法)을 수술(手術) 후(後) 혹(或)은 화학요법(化學療法)이나 방사선요법(放射線療法)와 병행(幷行)하여 치료효과(治療效果)가 향상(向上)되었다고 보고(報告)하고 있다. 항암제(抗癌劑)의 항암효과(抗癌效果) 정도(程度)를 검사(檢査)하는 방법(方法)은 크게 5가지로 분류(分類)되는데, 하나는 세포(細胞)를 약제(藥劑)에 노출(露出)시킨 후 현미경(顯微鏡)을 통하여 나타난 형태학적(形態學的) 변화(變化)를 가지고 약제(藥劑)의 효과정도(效果程度)를 결정(決定)하는 방법(方法)이고, 둘째는 Dye exclusion assay방법(方法)으로 살아있는 세포(細胞)가 trypan blue, eosin, nigrosin과 같은 염색액(染色液)에 염색(染色)되지 않는 점을 이용(利用)한 것이며, 세번째는 항암제(抗癌劑)의 항암효과(抗癌效果)를 알아보는 지표(指標)로 사용(使用)되는 Crrelease assay가 있으나, 세가지 방법(方法) 모두 현재(現在) 사용(使用)되고 있지 않다. 넷째로는 세포(細胞) 대사(代謝)의 방해정도(妨害程度)를 측정(測定)하거나 세포내(細胞內) 방사성(放射性) 동위원소(同位元素)의 유입방해(流入妨害) 정도(程度)를 측정(測定)하는 방법(方法)이 있고, 다섯째로는 본(本) 실험(實驗)에서 사용(使用)한 방법(方法)으로 stem cell assay라고도 하는 clonogenetic assay가 있는데, 이는 세포(細胞)를 약제(藥劑)에 노출(露出) 시킨 후 soft agar에 single cell suspension으로 배양(培養)하여 그 세포(細胞)의 분열(分裂).증식능력(增殖能力)을 측정(測定)하는 방법(方法)이다. 이 방법(方法)은 특히 성장(成長) 특성(特性)이 다른 종양세포(腫瘍細胞)의 경우 개개(個個) 세포(細胞)에 대한 약제효과(藥劑效果)를 반영(反映)할 수 있어서 종양세포(腫瘍細胞)의 이질성(異質性)에 따른 차이점(差異點)을 보정(補整)할 수 있는 방법(方法)이며, 1971년(年) Park 등이 마우스 골수종(骨髓腫) 세포(細胞)에 대한 stem cell assay를 시행(施行)해 본 결과(結果) in vivo에서의 결과(結果)와 잘 일치(一致)하여 그 이후로는 종양세포(腫瘍細胞)에 대한 항암제(抗癌劑)의 약제(藥劑) 감수성검사(感受性檢査)에 많이 사용(使用)되고 있다. 진령탕가감방은 담습응결(痰濕凝結)을 치료(治療)하는 효능(效能)을 가진 처방(處方)으로 거담작용(祛痰作用)을 가진 반하(半夏), 패모(貝母), 거습작용(祛濕作用)을 가진 의이인(薏苡仁), 백복령, 이기(理氣) 하기작용(下氣作用)을 가진 진피(陳皮), 대자석, 정향(丁香), 비파엽(枇杷葉), 항암작용(抗癌作用)을 가진 용규(龍葵), 반지련(半枝蓮), 모려(牡蠣), 하고초(夏枯草), 저령 등(等)의 약물(藥物)로 구성되어 있다. 근래(近來) 단일약물(單一藥物)의 항암효과(抗癌效果)에 대한 실험적(實驗的) 연구(硏究)로는 금(金) 등에 의한 인삼(人蔘), 녹용(鹿茸)의 항체생산(抗體生産) 억제(抑制) 완화효과(緩和效果) 및 임(任)에 의한 어성초(魚腥草), 녹혈(鹿血), 저령, 천산갑(穿山甲) 등이 정상(正常) 면역세포(免役細胞)에는 거의 독작용(毒作用)을 일으키지 않으면서 강력(强力)한 항암효과(抗癌效果)가 있다는 보고(報告), 금(金) 등에 의한 자완, 동풍채(東風菜), 영지(靈芝), 선학초(仙鶴草), 파두(巴豆) 등이 항암작용(抗癌作用) 및 면역반응(免疫反應)에 효과(效果)를 미친다는 보고(報告) 등이 있고, 복합제제(複合製劑) 약물(藥物)의 항암효과(抗癌效果)에 대한 연구(硏究)로는 강(姜) 등에 의한 식분환(息賁丸), 비기환(肥氣丸) 및 비기환이 백혈병(白血病)과 임파종환자(淋巴腫患者)에서 추출(抽出)한 암세포(癌細胞)에 항암효과(抗癌效果)가 있다는 보고(報告) 및 금(金) 등에 의한 복량환(伏梁丸), 비기환 및 소적정원산(消積正元散)이 각종(各種) 암세포주(癌細胞柱)이 성장저애(成長沮碍) 효과(效果), 윤(尹) 등에 의한 육군자탕(六君子湯), 소시호탕(小柴胡湯), 사묘탕(四妙湯), 대시호탕(大柴胡湯), 방독탕(防毒湯), 반하백출천마탕(半夏白朮天麻湯), 파두(巴豆)를 가미(加味)한 사군자탕(四君子湯) 및 사물탕(四物湯) 등이 항암작용(抗癌作用) 및 면역반응(免疫反應)에 효과(效果)를 보인다는 보고(報告) 등이 있었으나, 아직까지 진령탕가감방의 항암효과(抗癌效果)에 대한 실험연구(實驗硏究)는 없었다. 이에 저자(著者)는 항암효과(抗癌效果)가 있을 것으로 추정(推定)되는 진령탕가감방의 항종양효과(抗種瘍效果)를 알아보기 위하여, 수용성(水溶性) 추출액(抽出液)을 얻은 후 현대(現代) 병리학적(病理學的)으로 다용(多用)하는 colony형성억제실험(形成抑制實驗), SRB assay에 의한 항종양효과(抗種瘍效果), 생명연장율(生命延長率), 화학적(化學的)인 방법(方法)과 암종세포(癌腫細胞) 이식(移植)에 의한 종양(腫瘍) 유발(誘發)을 통하여 암(癌) 발생(發生) 및 그 경과(經過)에 미치는 영향(影響) 및 NK세포활성(細胞活性)에 미치는 영향(影響) 등을 관찰(觀察)하였다. 본(本) 실험(實驗)에서는 진령탕가감방의 종양세포(腫瘍細胞)에 대한 증식억제작용(增殖抑制作用)을 관찰(觀察)하고자 in vitro test인 colony형성억제실험(形成抑制實驗)과 SRB assay를 이용(利用)하였는데, 진령탕가감방의 추출액(抽出液)이 종양세포(腫瘍細胞)의 성장(成長)을 억제(抑制)하는 효과(效果)가 농도의존적(濃度依存的)으로 증가(增加)하는 결과(結果)를 보여 항종양(抗腫瘍)의 효과(效果)가 있음을 나타냈고(Table 3, 4), in vivo assay로서 sarcoma 180 복수암세포를 이식(移植)한 마우스의 평균생존일수(平均生存日數)를 관찰(觀察)하여 NCI protocol에 의하여 검정(檢定)한 결과(結果), 진령탕가감방 추출액(抽出液)을 투여(投與)한 마우스의 평균생존기간(平均生存期間) 및 생명연장율(生命延長率)이 뚜렷하게 증가(增加)되었다(Table 5). 또한 진령탕가감방 추출액(抽出液)을 마우스에 투여(投與)하면 MCA로 유도(誘導)한 종양(腫瘍) 및 3LL 세포(細胞) 이식(移植)에 의한 종양(腫瘍)의 발생율(發生率) 및 발생(發生)된 종양(腫瘍)의 크기가 현저히 감소(減少)되었다(Table 6, 7). 이러한 효과(效果)는 진령탕가감방이 감수성(感受性) 암종세포(癌腫細胞)에 직접적으로 영향(影響)을 미쳐 그 증식(增殖)이 억제(抑制)되었을 가능성(可能性)을 생각할 수 있다. 그렇지만 본(本) 연구(硏究)에서는 암종특이성(癌腫特異性)에 관한 결론(結論)을 내릴 수는 없으므로 암종특이성(癌腫特異性)에 관한 연구(硏究)는 진행(進行)해야 할 것으로 생각된다. 또 다른 가능(可能)한 진령탕가감방 추출액(抽出液)의 항종양(抗腫瘍) 작용기전(作用機轉)은 진령탕가감방 추출액(抽出液)이 NK세포(細胞)의 활성(活性)을 항진(亢進)시킨 실험결과(實驗結果)로 유추(類推)하여, 진령탕가감방 추출액(抽出液)이 종양(腫瘍)마우스에 비특이적(非特異的)인 면역활성(免疫活性)을 촉진(促進)시킴으로써 진령탕가감방 추출액(抽出液)의 항종양작용(抗腫瘍作用)이 발현될 가능성(可能性)도 생각할 수 있다. 따라서 앞으로 여러 암종세포(癌腫細胞)에 대한 진령탕가감방 추출액(抽出液)의 항종양작용(抗腫瘍作用)과 종양동물(腫瘍動物)에서의 진령탕가감방 추출액(抽出液) 투여(投與)에 의한 생체생리현상(生體生理現象)의 변화(變化), 생리활성물질(生理活性物質)의 본능(本能) 등을 밝히기 위한 보다 구체적(具體的)이고 광범위(廣範圍)한 연구(硏究)가 수행(隨行)되어져야 되리라고 사료(思料)된다. 세포성(細胞性) 면역반응중(免疫反應中) 중요(重要)한 역할(役割)을 하는 작동세포중 NK세포(細胞)는 여러 종양(腫瘍)에 대해 자연살해능(自然殺害能)을 보여 소위 T비의존성(非依存性) 면역감시기전(免疫監視機轉)에 관하여는 바이러스 및 세균(細菌)에 감염(感染)된 세포(細胞)를 파괴(破壞)하는 활성(活性)을 가지며, IL-2 및 Interferon 등에 의하여 활성(活性)이 증가(增加)된다. NK세포(細胞)가 표적세포를 파괴(破壞)하는 기전(機轉)에 관해서는 아직 확실히 알려져 있지 않으나, 첫째로 표적세포를 인식(認識)하는 시기(時期), 둘째로 융해기전(融解機轉)을 활성화(活性化)시키는 시기(時期), 셋째로 NK lymphotoxin이 유리(遊離)되는 시기(時期), 넷째로 표적세포의 사멸기(死滅期)로 나눌 수 있다. 본(本) 실험(實驗)에서 진령탕가감방 추출액(抽出液)으로 전처리(前處理)시 NK세포(細胞)의 표적세포와의 결합능(結合能)은 물론 결합(結合)된 표적세포의 융해능(融解能)이 촉진(促進)된 결과(結果)를 보이는데(Table 8), 이와 같은 결과(結果)는 진령탕가감방 추출액(抽出液)이 NK세포(細胞)의 표적세포 파괴 4단계 전체를 항진(亢進)시킨 결과(結果)로 인정(認定)된다. 이상에서 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 진령탕가감방 추출액(抽出液)을 폐암세포주인 A549와 간암세포주인 hep3B 및 신장암 유래의 종양세포주인 Caki-1 cell에 투여(投與)한 결과, in vitro test인 colony형성억제실험(形成抑制實驗)과 SRB assay에서 모두 농도의존적(濃度依存的)으로 암세포주 성장(成長)을 억제(抑制)하였다. 2. Strcoma 180세포(細胞)를 마우스에 이식(移植)하여 평균생존기간(平均生存期間) 및 생명연장율(生命延長率)을 측정(測定)하는 in vivo test에서는 진령탕가감방 추출액(抽出液)이 마우스의 평균생존기간(平均生存期間) 및 생명연장율(生命延長率)을 증가(增加)시키는 결과(結果)를 보였다. 3. 진령탕가감방 추출액(抽出液)은 MCA로 유도(誘導)한 종양(腫瘍)의 발생율(發生率) 및 발생종양(發生腫瘍)의 크기를 현저히 감소(減少)시켰으며, 3LL세포(細胞) 이식(移植)에 의한 종양발생(腫瘍發生) 또한 현저히 감소(減少)시켰다. 4. 진령탕가감방 추출액(抽出液)은 NK세포(細胞)의 활성도(活性度)를 증가(增加)시켰다. 특히 $10{\mu}g/ml$ 농도 에서 NK세포(細胞) 활성도(活性度)가 가장 현저히 증가(增加)되었다. 이상(以上)의 결과(結果)로 보아 진령탕가감방은 암종세포(癌腫細胞)에 대한 직접적(直接的)인 성장억제(成長抑制) 및 세포(細胞)의 활성(活性)을 통한 면역증진(免疫增進)에 의해 다양(多樣)한 항종양효과(抗腫瘍效果)를 보인 것으로 사료(思料)된다.