키토산으로부터 고중합도 키토산올리고당을 얻기 위해서, 해안가 갯벌토양 중에서 chitosan 분해활성이 강한 균주를 선발하였다. 선발된 균주를 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology을 토대로 형태적, 생화학적 특성을 동정한 결과, 그람 양상, 간상 $(0.4-0.6{\times}1.6-2.2{\mu}m)$, catalase 양상, 운동성 양성이었으며 pH 4.5-11.0과 2% NaCl을 함유한 배지에서 성자하였고, $42^{\circ}C$ 이하에서 성장하였다. 이들 균주의 DNA를 PAPD PCR 분석하여 동정하였다. 이 결과를 종합하여, 가장 강한 내부가수분해를 보인 균주 P16을 Bacillus sp.로 잠정 분류하고 이를 최종적으로 Bacillus sp. P16으로 명명하였다. 이 균주의 배양 상등액은 키토산에 대해 강한 액화능을 보였으며, 키토산 용액의 점성을 신속히 감소시켰다. 이 균주가 생산하는 키토산분효소는 TLC, HPLC, viscometry 등의 분석결과를 보건대 중합도 2-7의 올리고당을 생산하는 endo-splitting type의 endochitosansane인 것으로 보였다.
간장을 속성으로 제조할 목적으로 간장국을 고온(40, 45, 5$0^{\circ}C$) 으로 속성분해 하는 조건을 검토하였다. 국의 고온분해시 4$0^{\circ}C$에서 식염 농도가 15%이상, 45$^{\circ}C$에서는 12%이상, 5$0^{\circ}C$에서는 8%이상에서 국 분해액이 안전하였다. 총질소의 용출은 5$0^{\circ}C$, 식염농도가 9%일 때 1.75%로 가장 높은 수치를 나타내었다. 환원당은 45$^{\circ}C$에서 식염농도가 12%일 때 7.2%이였고, formol질소는 45$^{\circ}C$에서 식염농도가 12%일 때 0.9%이었다. 점도는 45$^{\circ}C$에서 식염농도가 15%일때 12일 경과시 점도가 제일 양호하였다. 한편 국 분해액에서 추출된 유리 아미노산은 45$^{\circ}C$일 때 3268mg%로서 가장 높았다. 유리 아미노산 중 glutamic acid, leucine, arginine, aspartic acid, lysine, valine 및 phenylalanine이 전체 아미노산의 절반 이상을 차지 하였다.
본 연구는 현재 사용되고 있는 석유화학계 접착제를 대체하기 위하여 바이오 디젤 부산물인 유채박을 세 종류(cellulase, pectinase, protease)의 효소를 단독 또는 조합하여 개량한 후 phenol formaldehyde (PF) prepolymer와 혼합하여 접착제를 제조하였으며, 이렇게 조제된 접착제를 적용시킨 합판의 접착능 및 포름알데히드 방산량을 조사함으로써 유채박의 합판용 접착제를 위한 원료화 가능성을 확인하고자 하였다. 유채박 접착제는 효소의 종류와 PF prepolymer의 몰비에 따라 6.26~8.81의 pH와 2,980~4,610 cps 점도를 보였으며, 고형분 함량은 33% 내외인 것으로 조사되었다. 유채박 접착제로 제조된 합판의 접착능 및 포름알데히드 방산량을 조사한 결과, cellulase 또는 cellulase와 pectinase를 이용하여 순차적으로 가수분해한 유채박 가수분해물과 1.8-F/P PF prepolymer로 조제한 접착제를 적용시킨 합판의 건조 및 준내수 인장강도가 가장 높았으며, 그 값은 KS F 3101의 보통합판에 관한 최소 규정치인 0.6 N/$mm^2$를 초과하는 것으로 나타났다. 한편 유채박 접착제로 제조된 합판의 포름알데히드 방산량은 전반적으로 1.0 mg/${\ell}$를 초과하지 않았으며, 대조구인 요소수지 접착제로 제조된 합판의 포름알데히드 방산량(2.69 mg/${\ell}$)과 비교하여 상당히 낮았다. 본 연구 결과로부터 유채박 접착제가 합판용 접착제로써 사용될 수 있다는 가능성을 제시할 수 있었으며, 유채박의 가수분해에 사용된 효소의 양 및 가수분해 시간을 조절하거나, 고형분 함량을 증가시켜 열압온도와 시간을 줄이는 방안 등이 유채박 접착제의 상용화를 위하여 향후 추가 연구가 되어야 할 것으로 생각한다.
가금류 우모는 환경오염 물질이자 병원성 세균의 저장소로 간주되는 축산폐기물이다. 따라서 우모 폐기물을 관리하기 위한 지속 가능하고, 환경친화적인 방법을 개발하는 것은 매우 중요하다. 본 연구는 폐기된 닭의 우모로부터 분리된 Y10 균주를 동정하고, 특성화하기 위하여 수행되었다. Y10 균주는 표현형 및 16S rRNA 유전자 분석을 통해 Bacillus amyloliquefaciens에 속하는 것으로 확인되었다. B. amyloliquefaciens Y10은 곰팡이 세포성분을 분해하는 효소(cellulase, lipase, protease and pectinase), siderophore, 암모니아 및 IAA 생성과 같은 식물 성장 촉진 활성을 나타내었다. 나아가 Y10 균주는 일부 식물병원성 곰팡이의 균사체 생육을 억제할 수 있었다. 기본배지에 탄소원으로 sucrose 0.1%, 질소원으로 casein 0.05%를 첨가한 후, 배지의 pH를 10으로 조정하여 35℃에서 배양했을 때, 실험균주에 의한 우모 분해율은 기본배지 대비 약 2배 증가되었으며, 배양 4일에 우모는 완전히 분해되었다. 또한 실험균주는 개선된 조건에서 오리 우모, 양모, 사람의 손발톱과 같은 다양한 케라틴 기질을 분해할 수 있었다. Y3 균주를 이용하여 조제된 우모 분해산물은 DPPH 라디칼 소거능(EC50 = 0.38 mg/ml)과 SOD 유사활성(EC50 = 183.7 mg/ml)과 같은 항산화능이 있음을 확인하였다. 이 결과는 실험균주는 케라틴 폐기물의 미생물학적 처리뿐만 아니라 농축산 산업에 적용할 수 있는 생물 비료, 생물 농약 및 사료첨가제 개발의 잠재적인 후보가 될 수 있을 시사한다.
최근 아임계수 가수분해는 전통적인 단백질 가수분해법의 대체방법으로서 관심을 받고 있으며, 고단백질원으로부터 아미노산을 회수하는데 효과적인 공정이 될 수 있을 것으로 기대되고 있다. 본 연구에서는 대표적인 식물성 단백질원인 분리대두단백질을 선택하여 대두단백질의 아임계수 가수분해에서 가장 중요한 인자인 대두단백질의 초기농도, 반응온도, 반응시간의 영향을 연구하여 대두단백질로부터 아미노산을 생산할 수 있는 조건을 최적화하고자 하였다. 대두단백질 수열분해액의 실온에서 pH는 $200^{\circ}C$에서 20분간 처리했을 때 pH는 7.3으로 중성이었으나 온도가 증가할수록 pH가 증가하여 $270^{\circ}C$에서 10.3으로 알카리성을 나타내었다. 반응온도 $220^{\circ}C$까지는 수열분해액은 분산상태를 이루었으나 $230^{\circ}C$ 이상에서는 분산상태가 파괴되고 단백질이 분리되어 하부에 침강층을 이루었으며 $240^{\circ}C$ 이상에서는 이 단백질층이 현저히 감소하였다. 반응온도는 $250^{\circ}C$, 반응시간 20분으로 고정한 조건에서 대두현탁액의 초기농도가 수열분해에 미치는 영향을 살펴본 결과 초기농도 10% (w/v)일 때 가수분해도 및 아미노산 수율이 각각 16.2% 및 22.3%로 가장 우수하였다. 또한 반응온도 $200-220^{\circ}C$ 범위에서는 가수분해도와 아미노산 수율은 서서히 증가하였으나 $230-250^{\circ}C$ 영역에서는 급격히 증가하였으며 $250^{\circ}C$ 이상에서는 다시 완만히 증가하는 경향을 보여 $250^{\circ}C$ 이상에서 아미노산 분해속도는 단백질 분해속도를 초과하였다. 표면반응분석법으로 예측한 결과 $268^{\circ}C$, 처리시간 35분에서 최적 아미노산 수율 43.5%를 얻을 수 있었다.
효소를 이용하여 대구피 젤라틴 가수분해물을 연속적으로 생산하기 위해 한외여과막 반응기에서의 젤라틴 가수분해 최적 공정조건 및 한외여과막 반응기를 장시간 작동하였을 때의 효소활성 저하원인을 규명하였다. 효소농도가 0.4mg/ml까지 증가함에 따라 기절의 전환율은 증가하였으나 기질의 경우는 농도가 증가함에 따라 전환율이 감소하였다. 유량(Flux)이 클수록 전환율은 감소되었으며 잔류시간이 길수록 전환율을 증가하였다. 한외여과막 반응기 장치의 작동시 가질의 전환율은 반응시간 1시간 부근에서 최대 전환율을 나타내었으며 시간당(8시간 작동) 평균 전환율 감소는 2.1%였다. 한외여과막을 통한 효소 누출은 반응시간 10~60분 범위에서 최대였으며 6시간 이후에는 거의 누출되지 않았다. 전체 효소량 중 누출량은 $50^{\circ}C$에서 16%인데 비해 $35^{\circ}C$에서는 12%였다. 그러나 효소 누출과 기질 전환율 사이에 명백한 상호관계는 나타나지 않았다. 막에 의한 효소의 활성저하는 작동시간 120분까지 나타났으며, 이때 초기속도의 36%가 저하하였다. 연속식(CSTMR)에서 $K_m$ 값은 회분식의 그것보다 20배 큰 반면 $K_2$ 10.5배 낮았다. 최적 가수분해조건은(기질농도 10%, $50^{\circ}C$, pH 8.0, 유량 7.31ml/min, 잔류시간 82분, S / E = 50w / w) 하에서의 생산량은 효소 mg당 가수분해물이 285mg으로 회분식 44.8mg에 비해 6배 이상이었다.
키토산 올리고당 생산에 이용 가능한 경제성 있는 키토산 분해 효소를 탐색하였다. Cellulase, ${\beta}-1,4-glucosidase,\;protease$ 및 상업용 효소류를 대상으로 조제 키토산에 대한 분해력을 시험한 결과 Trichoderma viride, T. reesei 유래의 cellulase 및 상업용 효소인 Celluclast (T. reesei 유래 cellulase)가 우수한 키토산 분해능력을 나타내었다. 키토산에 대한 반응성은 T, reesei 유래 cellulase가 T. viride 유래 cellulase 보다 강하였으며 이들의 적정 키토산 분해조건은 pH 5.0이었고 적정 온도는 T. viride 유래 celluclast는 $45^{\circ}C$, T. reesei 유래 cellulase 및 Celluclast는 $55^{\circ}C$로 나타났다. 또한 dose reponse시험에서 이들 효소 모두 enz./chitosan비=0.1이 적절하였으며 T. reesei 유래 효소 및 Celluclast는 키토산 농도가 3%일 때 최대의 활성을 나타내었다. 한편, 상업용 효소인 Celluclast를 이용한 키토산 올리고당의 생산 가능성을 시험하기 위하여 3% 키토산 용액(310cp)에 Celluclast를 1% 첨가하고 $pH\;5.0,\;55^{\circ}C$에서 시간별로 반응시켰을 때, 점도는 초기30분경에 5.51cp로 98% 이상 감소하였으며 50% ethanol 가용물의 수율은 분해 15시간에 70%로 최대를 보였다. 총환원당의 함량은 분해시간이 경과함에 따라 증가하였고 반응 2시간부터 13.5% 내외의 수준을 유지하였다. 올리고당의 조성은 15시간 분해물에서 균일한 분포와 높은 함량을 보였으며 항종 양활성을 나타내는 것으로 알려진 6량체 키토산 올리고당의 생성량은 기존의 산 분해방법의 약 4배에 해당되는 8.0%로 나타났다. 따라서 T. viride 및 T. ressei 유래의 cellulase는 99% 이상의 탈아세틸화도를 가지는 키토산에 대하여 분해활성을 나타내고 특히 T. reesei유래의 상업용효소는 지금까지 효소가격이 너무 높아 활용되지 못한 chitosanase를 대신하여 키토산 올리고당을 경제성 높게 생산하는 데 이용될 수 있을 것으로 기대되었다.
식품에서의 쓴 맛 펩타이드의 형성 기작 및 분해에 의한 제거 방법을 알아보기 위하여 카제인 가수 분해물에서 쓴 맛 펩타이드를 분리하여 그 특성을 조사하였다. Bacillus subtilis가 생산하는 염기성 단백부내 효소를 순수 분리된 ${\alpha}_{s1}$-카세인과 ${\beta}$-카제인에 처리하여 카제인 가수 분해물을 만들고, 이 가수 분해물에서 용매 추출, Sephadex G-25 겔 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용해 쓴 맛 펩타이드를 순수 분리했다. 고성능 액체 크로마토그래피는 역상 칼럼인 octadecylsilica 칼럼을 사용했고, 0.1% TFA와 80% $CH_3CN$의 linear gradient 방법을 이용했다. ${\alpha}_{s1}$-카제인 가수분해물에서 3가지 쓴 맛 펩타이드를 분리하였는데, BP-I은 $CH_3CN$ 34%에서, BP-II는 35%, BP-III는 26%에서 각각 용출되었다. ${\beta}$-카제인 가수 분해물에서 2가지 쓴 맛 펩타이드를 분리했는데, BP-IV는 $CH_3CN$ 40%에서, BP-V는 42%에서 용출되었다. 분리된 다섯 가지 펩타이드 중 BP-V가 가장 소수도가 높았으며, 쓴 맛은 BP-I과 BP-II가 가장 강했다.
키토산 및 키토산 올리고당의 김치관련 미생물에 대한 항균특성을 검토하였다. 분자량 및 탈아세틸화도가 다른 5종의 키토산을 조제하여 김치에 첨가한 후, 관능검사, pH 및 산도를 검토한 결과, C-4 및 C-5(탈아세틸화도 $92{\sim}99%$, 분자량 $16,700{\sim}32,000)$가 우수한 조직감을 나타내었고 숙성적기로 평가된 대조구의 pH 4.1, 산도 0.50% 시점에서 pH 4.9 및 산도 0.35%를 나타내었다. 한편, C-4 키토산(분자량: 16,000, 탈아세틸화도: 99%)으로부터 $5{\sim}7$량체의 함량이 높은 키토산 올리고당을 조제하고 B. subtilis, B. cereus, Pse. fluorescens, E. coli, Lac. plantarum, Leu. mesenteroides, Lac. brevis, Ent. faecalis에 대하여 항균력을 측정한 바, 3.0% (w/v) 키토산은 $9{\sim}20mm$, 5.0% (w/v) 키토산 올리고당은 $8{\sim}24mm$의 성장억제환을 나타내었으며 키토산의 MIC는 $0.01{\sim}0.05%$ (w/v), 키토산 올리고당의 MIC는 $0.05{\sim}0.2%$로 나타났다. C-4 키토산 및 키토산 올리고당은 또한 초기, 적기 및 후기의 김치 유래 총 microflora에 대해서도 항균력을 나타내었고 특히 적숙기의 microflora에 대해서 가장 강한 항균력을 보였다. 따라서 C-4 및 키토산 올리고당은 김치의 저장성 개선제로서 응용이 가능할 것으로 기대되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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