• 미생물학회지
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• 제27권3호
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• pp.216-220
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• 1989

Aamylase 활성이 높은 Aspergillus oryzae와 알콜발효능이 있는 Saecharomyccs cerevisiae의 원형질체융합을 위한 기초연구로서, amylase 활성이 있는 A. oryzae의 종내원형질체를 융합시켜 이들융합체의 특성을 조사하였다. 영양요구성 돌연변이 균주의 mycellia로부터 원형질체를 생성하기 위해서는 lytic enzyme으로 Novozyme 234가 효과적이였고 완충용액의 pH는 5.5에서 6.0사이가 최적이었다. F usogen으로 30% PEG4,000를 사용하였을 때 효과적으로 원형질체의 융합이 이루어졌으며 이들 융합체의 대부부은 heterokaryons이었다. 원형질체의 형태와 PEG처리후 융합되는 과정을 광학현미경으로 관찰하였다. 원형질체의 재생율은 재생배지와 균주에 따라 1.46~14%이었고, A. oryzae 종내융합율은 0.12-0.16이었다. 융합체의 DNA함량을 조사한 결과 모균주보다 약 1.5배정도 증가됨을 보였고 융합체들의 amylase 활성은 융합체에 따라 다소 차이를 냐타내었다. 가장 높은 amylase 활성을 나타낸 융합체들의 amylase 활성은 융합체에 따라 다소 차이를 나타내었다. 가장 높은 amylase 활성을 나타낸 융합체 F2-2에 있어서는 야생균주 ATCC 22788의 그것보다 amylase 활성이 약 1.5배 가량 높았다.

• 한국균학회지
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• 제20권1호
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• pp.44-50
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• 1992

Rhizoctonia solani의 균사융합군(AG) 중에서 생장속도가 빠른 AG-1과 AG-4는 가장 많은 원형질체를 형성하였으며 속도가 느린 AG-3은 저조하였고 중간인 AG-2와 AG-5는 또한 중간이었다. 균핵의 형성은 AG에 따라 차이가 있었다. Cellulase "onozuka" R-l0, macerozyme R-10, ${\beta}-glucuronidase$의 효소 복합액에서 가장 많은 원형질체를 형성하였다. 5개 융합군은 30시간 배양한 3g의 균사를 0.6 M mannitol이 첨가된 효소 복합액에 $32^{\circ}C$에서 3-4시간 처리하면 가장 많은 원형질체를 형성하였다. 균핵을 형성하는 AG-1을 열처리로 불활성화시킨 후 균핵을 형성하지 않는 AG-5의 원형질체를 PEG와 ${Ca}^{2+}$로 융합시켰다. 재생배지상에서의 균총의 특징과 균핵의 형성에 의해 7 개의 원형질 융합체를 선발하고 esterase 동위효소의 zymogram 및 AG-1 과 융합체인 F150l 사이에서 일어나는 killing reaction으로 확인하였다.

• 미생물학회지
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• 제30권3호
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• pp.207-212
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• 1992

합성세제 분해능이 월등한 Pseudomonas putida 와 프탈산에스테르를 분해하는 Arthobacter spp. 의 세포융합을 통해 합성세제와 프탈산에스테르의 분해능을 모두 갖는 융합균주를 개발하였다. Ampicillin-Lysozyme-EDTA 에 의한 각 균주의 원형진체 생성율은 98.4%-99.9% 이었고 원형질체의 재생율은 5-8%이었다. Fusogen으로 40%PEG4000 을 이용하였을 때 효과적으로 융합이 이루어졌으며 융합율은 $1.8{\times}10^{4} $-2.9{\times}10^{4}$ 이었다. 선별된 융합체는 프탈산에스테르와 ABS 를 모두 분해하였으며 ABS 의 분해능은 모균주보다 약 20% 정도 분해능이 증가하였고 DEHP 의 분해능은 모균주와 비슷한수준이었으나 모균주보다 더 빨리 기질을 분해하였다.

• 미생물학회지
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• 제31권3호
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• pp.218-223
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• 1993

Conditions for the release and regeneration of protoplasts form Rhizopus oryzae and intergeneric protoplast fusion between Rhizopus oryzae and Aspergillus oryzae were studied. High yields of protoplast fusion between Rhizopus oryzae and Aspergillus oxyzae were studied. High yield of protoplasts from young germilings of R. oryzae were obtained by using lytic enzymes containing chitosanase (3 mg/ml), chitinase (3 mg/ml) and Novozym 234 (5 mg/ml). 0.5M glucose was used as the osmotic stabilizer and optimum pH of buffer was determined to be pH 7.5-8.0. Under these conditions, protoplasts were formed after about 3-4 hrs incubation. Approximately, 1.0%-4.9% of these protoplasts were formed after about 3-4 hrs incubation. Approximately, 1.0%-4.9% of these protoplasts regenerated on solid medium with a soft agar overlay. We have also carried out protoplasts fusion between R. oryzae and A. oryzae and have succeeded in obtaining three types of intergeneric fusants. In these experiments, 35% PEG-4000 and 10 mM CaCl$_{2}$ were used as fsogenic agents, and auxotrophic properties were used as a genetic marker to select fusants. Complementation frequency be protoplasts fusion of A. oxyzae and R. oryzae was 4.4% * 10$^{-5}$ . The fusant strains of the first type were prototrophs showing an Aspergillus type morphology with dark-yellow sporulation, those of the second type were also Apergillus type morphology but showed no sporulation. And the strains of the third type stopped growing when fusion products grown on regeneration minimal medium were transferred to fresh minimal medium. The formation of fusion products was observed by fluorescent vital stains for complementary labelling of protoplats from R. oryzae and A. oryzae. Rhodamine 6G and fluorescein diacetate wer useful complementary vital stains of Rhizopus and Aspergillus protoplasts for visualization of requency and type (dicell, multicell) of fusion.

• 생약학회지
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• 제27권3호
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• pp.231-237
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• 1996

The antitumor components of the protoplast fusants of Lentinula edodes and Ganoderma lucidum were examined for immunological activity to elucidate the mechanism of their antitumor activity. They did not show any direct cytotoxicity against tumor cells. But being examined for immunopotentiation activity, they increased the number of colonies in the bone marrow stem cells to 3.0 times. They also increased the activities of the acid phosphatase in activated macrophages to 2.1 times and the secretion of nitric oxide in RAW 264.7 to 2.2 times, respectively. They activated the components of the alternative complement pathway. In humoral immunity. they increased the activities of the alkaline phosphatase in differentiated B cells to 1.6 times and the number of plaque forming cells to 1.8 times, respectively. In cellular immunity, they restored the depressed response of delayed type hypersensitivity in tumor bearing mice to normal level.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제14권4호
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• pp.305-310
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• 1986

본 연구의 목적은 yeast중 glucoamylase를 분비하는 S. diastaticus와 발효성 효모인 S. cerevisiae 간의 세포융합을 하여 당화와 발효의 두 공정을 단일화하는데 있다. 각각의 Parental protoplast를 1:1로 섞은 후 PEG(M W. 4,000) 30%와 10mM CaCl$_2$용액으로 fusion시킨 결과 $10^{-4}$~$10^{-5}$ 빈도였으며, 총 fusant중 HSDD의 경우 24%, HSDM은 36.8%가 2 회의 subculture로 친주 유리의 auxotrophic cell로 segregation하였고, glucoamylase 생성 균주 중 HSDD는 9.7%, HSDM은 12.7%만이 S. diastaticus 야생주 수준의 효소 생성을 보였다. 이들 fusant의 특징을 조사해 본 바 원 Parent보다 세포의 크기가 클 순 아니라 DNA함량도 많았으며 S. cerevisiae가 spore을 전혀 형성하지 못한데 반해 융합체들은 spore을 잘 형성하였다. 이들의 fusant중 유전안정성 이 높고 glucoamylase 생성능도 강한 HSDD-170과 HSDM-119를 최종적으로 선별하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제16권4호
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• pp.303-309
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• 1988

Cellulose를 이용할 수 있는 Cellulomonas속 균주의 종간 세포의 융합방법을 확립하기 위해 원형질체 재생 및 융합조건에 대해 검토하였다. Cellulomonas속 균주의 원형질체는 osmotic stabilizer를 포함하는 재생배지에서 유동성 한천배지로 중층하여 재생시켰고 재생 확인은 주사전자현미경으로 하였다. 원형질체 융합은 항생물질 내성과 영양요구성 돌연변이주의 유전자 표지에 확인하였다. Lysozyme을 처리하여 형성된 C. flavigena 원형 질체의 세포벽 재생은 osmotic stabilizer로 0.4M sorbitol을 포함하는 재생배지에서 약 15% 수준이었으며 여기에 Polyvinyl Pyrrolidone(PVP) 3% 첨가로 재생율을 약 3배정도 증가시킬 수 있었다. Cellulomonas속 균주의 변이주간의 원형질체 융합은 융합유도제로 PEG 6000을 취하여 최적농도 40% (w/v), 치적 처리시간 15분, Ca농도 25mM에서 약 2.0$\times$$10^{-4}$ - 4.0$\times$$10^{-4}$의 융합빈도를 얻을 수 있었다.

• 한국균학회지
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• 제21권3호
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• pp.200-211
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• 1993

사철느타리버섯 Pleurotus florida 균주와 느타리버섯 P. ostreatus 2균주의 영양요구주로 원형질체 융합하여 체세포 잡종을 얻어 자실체의 특성과 후대의 유전자 재조합을 조사하였다. 사철느타리 ASI 2016의 ASI 2-3-rib와 느타리 ASI 2018의 ASI 2-1-arg의 원형질체 융합으로 40개의 체세포잡종($P1{\sim}P40$)을 얻어 그중 P5에서 얻은 유전자 재조합주 P5-M43-arg rib를 다시 느타리 ASI 2001의 ASI 2-13-pro orn과 융합하여 38개 체세포잡종 ($P41{\sim}P78$)을 얻었는데 생산력이 높고 품질이 우수한 P72를 "원형느타리버섯 Wonhyeongneutaribeosus"으로 명명하여 1990년에 보급하였다. 자실체의 갓 색택이 yellowish white인 사철느타리 ASI 2016과 bluish grey인 느타리 ASI 2018의 원형질체 융합주는 중간색인 brownish grey를 나타내었고, P5에 다시 violet grey인 느타리 ASI 2001을 융합한 것은 bluish grey를 나타내었다. 40균주($P1{\sim}P40$)의 자실체 생산량에 있어서 10%만이 양친보다 높았고 40%는 낮았으며 나머지는 양친과 유사하였는데 친주 ASI 2018의 수량지수를 100으로 할 때 융합주는 $27.0{\sim}155.2$로 나타났으며, 체세포 잡종 38균주($P41{\sim}P78$)에 있어서 21.0%는 양친보다 높았고 26.3%는 낮았으며 나머지는 양친과 유사하였는데 ASI 2001을 100으로 할 때 체세포 잡종은 $40.5{\sim}141.3$으로 잡종강세 현상이 나타났다. 수량에 영향을 주는 7 개 형질에 관한 특성에 있어서 P5는 양친주보다 유효경수와 대의 길이는 증가하나 갓의 크기, 대직경, 개체중은 감소하였고, 다발무게와 갓 두께는 유사하였으며, P49는 갓의 크기는 양친과 유사하나 나머지 6개 형질이 모두 증가하였으며 P72는 다발 유효경수와 갓의 크기는 양친과 유사하나 나머지 5개 형질은 모두 증가하였다. esterase 동위효소 분석 결과 P5는 양친의 밴드를 대부분 가지면서 새로운 밴드양상이 형성되었으며 융합주 P48, P49, P72의 상호간에는 밴드의 차이가 없었으나 양친인 ASI 2001과 P5의 밴드를 대부분 가지는 양상을 나타내었다. 사철느타리 ASI 2016과 느타리 ASI 2018의 4개 융합조합 7개 융합주의 유전형질 분리에 있어서 분리되는 유전자형은 원영양형 prototroph, 양친의 한쪽 편친형, 양친의 다른 편친형, 영양요구성 유전자 재조합형으로 나타나며 그 기대치는 1 : 1 : 1 : 1이나 원영양형이 가장 많았으며 2개 융합주를 제외하고는 양친 중 사철느타리 형질만 분리되었으며 양친형과 유전자 재조합형이 거의 1 : 1로 분리되었다. P5 유전자 재조합주 arg rib와 ASI 2001의 pro orn의 체세포 잡종 P48, P49, P72의 분리에 있어서 pro orn 친은 분리되지 않았으며 각 유전형질 arg, rib, pro, orn의 비가 P49, P72는 거의 4 : 1 : 1 : 1로 나타났으나 P48은 pro, orn형질이 훨씬 적게 나타났으며 유전자 재조합형의 비율이 아주 높은 91%이상이었다.

• 미생물학회지
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• 제26권2호
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• pp.82-87
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• 1988

The genetic analysis and characterization of protoplast fusion hybrids between complementary auxotrophic mutants of Candida pseudotropicalis were carried out. Nuclear fusion appeared to occur in fusion hybrids (e.g., F15 and F33), as strongly suggested by isolation of recombinants after mitotic segregation of parental genetic markers. This was confirmed by KNA content, nuclear staining and comparison of survival rate to UV light. After keeping fusion hybrids for approximately one year, the frequency of spontaneous mitotic segregation was $3.0\times 10^{-4}$ - $8.1\times 10^{-4}$ while that of induced mitotic segregation was $1.4\times 10^{-3}$- $1.7\times 10^{-3}$. These results suggested that they maintained stable karyogamy state. It was also found that the production of $\beta$-D-galactosidase from F15, F33 and F158 was somewhat increased when compared with that from either auxotrophic parents or wild type.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제25권2호
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• pp.121-128
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• 1997

A lactic acid bacterium was isolated from kimchi. The isolated strain was identified as the genus Lactobacillus through its morphological, cultural, and physiological characteristics and named as Lactobacillus sp. JC-7. The optimum conditions for the electrofusion between streptomycin (2.5 mg/ml) resistant mutant of Lactobacillus acidophilus 88 and kanamycin (600 $\mu$g/ml) resistant mutant of Lactobacillus sp. JC-7 were evaluated. The highest number of fusants were obtained at a capacitance value of 120 msec (1670 $\mu$F), a field strength of 100 V/cm, and a pulse controller setting of 72$\Omega$. The optimum pH of electroporation buffer was 7.5 and the concentration of divalent cation was 1 mM Mg$^{2+}. Electrofusants were efficiently obtained by addition 20% polyethylene glycol to elec- troporation buffer. The yield of fusion was better than that of using polyethylene glycol mediated chemical induction.