• Applied Microscopy
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• 제51권
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• pp.16.1-16.7
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• 2021

Electron microscopy (EM) is an essential imaging method in biological sciences. Since biological specimens are exposed to radiation and vacuum conditions during EM observations, they die due to chemical bond breakage and desiccation. However, some organisms belonging to the taxa of bacteria, fungi, plants, and animals (including beetles, ticks, and tardigrades) have been reported to survive hostile scanning EM (SEM) conditions since the onset of EM. The surviving organisms were observed (i) without chemical fixation, (ii) after mounting to a precooled cold stage, (iii) using cryo-SEM, or (iv) after coating with a thin polymer layer, respectively. Combined use of these techniques may provide a better condition for preservation and live imaging of multicellular organisms for a long time beyond live-cell EM.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제40권4호
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• pp.148-154
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• 2013

Objective: To compare the mouse oocyte vitrification outcomes of the CryoLogic vitrification method (CVM) and the conventional open method using a Cryotop. Two CVM methods (original CVM and modified CVM) were tested. Methods: Mature oocytes obtained from female BDF-1 mice were vitrified by two-step exposure to equilibrium and vitrification solutions. Three vitrification protocols were tested on three groups: the CVM-kit, modified CVM, and Cryotop groups. After exposure to the two solutions, the oocytes were vitrified. After warming, the oocytes were fertilized in vitro, and the embryo development was assessed. Blastomeres positive for caspase were counted using an in situ assay kit. The spindle morphology and chromosome configurations of warmed vitrified oocytes were also assessed. Results: The modified CVM and Cryotop groups showed similar developmental capacities, and similar proportions of cells with intact spindles and chromosome configurations. The modified CVM protocol was superior to the original CVM protocol for developmental competence and intact spindle preservation. However, the CVM group showed a relatively higher number of apoptotic cells in blastocysts. Conclusion: Closed vitrification using the modified CVM protocol may be used as an alternative to the conventional open method, but strategies to decrease apoptosis in the blastomere need to be investigated.

• 한국수정란이식학회지
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• 제25권3호
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• pp.189-193
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• 2010

We investigated the cleavage rate and blastocyst yield for each culture condition to enhance tolerance of cryo-preservation of bovine IVF embryo with relatively lower cryo-tolerance compared to in vivo embryo. The cleavage rate and blastocysts yield for CR1aa, IVMD, IVD, CR1aa+10% FBS were 73.2, 69.3, 72.8, 68.5% and 44.1, 30.8, 33.3, 48.0%, respectively. The values did not differ among each treatments without serum. For embryo vitrification, In vivo and In vitro blastocysts were exposed to VS1(10% glycerin, 0.1 M glucose, 0.1 M sucrose, PEG 1%) for 5 min, and VS2 (10% glycerin, 10% EG, 0.2 M glucose, 0.2 M sucrose, PEG 2%) for 5 min and then VS3 (10% glycerin, 30% EG, 0.3 M glucose, 0.3 M sucrose, PEG 3%) for 1 min. The exposed embryos were then loaded into the 0.25 ml plastic straws and then plunged into liquid nitrogen. The straws were held for period of 1 to 2 weeks before thawing. In embryo viability, no differences in blastocyst re-expansion rates were found between in vivo and in vitro embryos. whereas expansion-BL rates was significantly higher for in vivo-derived embryos (72.7%) when compared to in vitro-derived embryos (51.4%), respectively (P<0.05). In conclusion, our results indicate that combined use of CRIaa culture medium with vitrification might enhance tolerance of cryopreservation for bovine IVF embryo production.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제33권7호
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• pp.1068-1076
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• 2020

Objective: In the present study, we determined efficiency of incorporating caffeine, melatonin or omega-3 polyunsaturated fatty acid in the diluent on mitigating consequences of (a) liquid chilled- and (b) cryo-storage of ram spermatozoa. Methods: In the first experiment, ejaculates (n = 30) were collected from 5 adult rams and were pooled, diluted (1:10) with Tris-citric acid (base diluent) and were split into 4 aliquots assigned for: control (untreated), caffeine (0.1 mM), melatonin (0.3 mM) or omega-3 fatty acids (0.3 mM) (T₀). The diluted specimens were stored at 4℃ for 48 h, during which sperm physical and cytological properties were evaluated along with oxidative stress indices (T₂₄, T₄₈). In the second experiment, 15 ejaculates (3 per male) were pooled, diluted with glycerolized base diluent (4% glycerol, v/v) and were split corresponding to the same previous treatment groups before being processed for cryopreservation. Post-thaw physical and kinematic sperm properties were assessed by a computer-assisted sperm analysis system. Results: The results clarified superiority of both melatonin and omega-3 supplementation on maintaining (p<0.05) sperm properties, while reducing (p<0.05) lipid peroxidase reaction and enzymatic activities of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, and alkaline phosphatase in preservation medium, compared to caffeine either during liquid-chilled storage or cryopreservation of spermatozoa. Conclusion: Melatonin and omega-3 are regarded efficient alternatives to caffeine when processing ram spermatozoa for application of artificial insemination or in vitro fertilization.

• 한국축산식품학회지
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• 제29권4호
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• pp.437-444
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• 2009

GABA 생성 젖산균으로 선발한 Lactobacillus acidophilus RMK567 균주를 멸균한 50 L의 MRS broth가 들어 있는 fermenter에 접종하여 40oC의 발효온도에서 24시간 배양 하였다. L. acidophilus RMK567 생균수는 $10.04{\pm}0.13$ Log CFU/mL이었으며, 이때 5.16시간의 유도기(L)를 거쳐 2.203시간의 세대시간(g)으로 증식하였으며, 생장률상수(k)는 0.454세대/h 이었다. 50 L의 MRS 배양액으로부터 회수한 cell paste의 총 중량은 487 g, 수분함량은 40.5%이었으며, 생균수는 12.48 Log CFU/g 이었다. Cell paste에 glycerol, glucose 및 polydextrose 등의 동결보호제를 첨가하여 $-45^{\circ}C$에서 deep frozen하고 84 mtorr의 진공 하에서 3시간 동결건조하여 총 408 g의 FD cell powder를 생산하였다. FD cell powder에 Streptococcus thermophilus를 혼합한 FD starter cultures의 수분함량은 4.25%, 3.90%, 및 4.08%이었으며, 생균수는 각각 12.42(FDA-GY), 12.60(FDB-GG)과 12.91(FDC-GP) Log CFU/g이었다. 모든 FD starter cultures는 $-18^{\circ}C$ 저장 초기부터 급속히 사멸하여 3.24% 이하의 생존률을 보였다. 각 동결보호제 처리구 간의 생균수 차이는 유의성을 보이지 않았으나, 저장기간에 따른 유의성은 p<0.01 수준에서 관찰되었다. 원유를 기초로 하는 요구르트 조제액에 MSG의 농도를 0.02%, 0.04% 및 0.05%을 첨가하고, FD starter culture로 배양한 요구르트의 GABA 함량은 각각 $155.16{\pm}8.53$ ppm, $243.82{\pm}4.27$ ppm 및 $198.64{\pm}23.46$ ppm 이었다. 이 결과는 L. acidophilus RMK567의 FD starter culture가 동결건조 공정에 의하여 GABA 생성력이 감소하지 않았으며, GABA 함량이 높은 요구르트 제조에 유용하다는 사실을 보여주는 것이었다.

• 한국산림과학회지
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• 제98권1호
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• pp.115-124
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• 2009

새로운 균주가 육종되었을 때 그 균주가 장기간 고유특성을 유지하기란 쉽지 않으며, 시간이 경과 할수록 균주는 퇴화를 거듭한다. 이에 따라 현재 많이 이용되고 있는 초저온에서의 균주보존 후 균사의 활력과 온도가 생존에 미치는 영향과 표고균주가 동결하는 동안 나타나는 상태변화를 이해하고자 하였다. 저온 처리별 균주보존결과 표고균주의 생존은 $-20^{\circ}C$에서 50일간 보존하면 사멸했으며, $-80^{\circ}C$와 $-196^{\circ}C$에서 보존한 균주들은 온도에 영향을 받지 않고 생존하였다. 저온 처리별 균사생장속도는 $-80^{\circ}C$에서 보존한 균주들의 재생속도가 가장 빨랐다. 균사의 정단부분과 말단부분에 대한 저온 처리별 균주보존 결과 부분별 위치는 균사의 활력과 생존에 영향을 끼치지 못했다. 프로그램이 가능한 동결장치를 이용하여 표고균주의 동결과정에서 나타나는 현상을 조사한 결과 균주별 각기 다른 어는점을 가지고 있었다. 또한 표고의 자실체 발생 온도형과 균주별 어는점과의 관계는 관련이 없었다. 프로그램이 가능한 동결장치를 이용하여 표고균주의 동결과정에서 나타나는 상태변화를 최소화하기 위해 일시적으로 낮은 온도로 동결을 시도하였지만 균주들은 온도에 영향을 받지 않았다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권2호
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• pp.133-145
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• 2004

난자의 체외성숙 및 체외배양에는 일반적으로 동물의 혈청을 사용하고 있다. 그러나, 채취한 소의 상태에 따라서 혈청의 질에 차이가 있어 실험데이터가 일정하지 않을 수 있고, 그것으로부터 바이러스, 세균, 마이코플라즈마 등에 오염될 가능성이 있다. 따라서, 본 실험에서는 완전 무 혈청 배양액에서 난자의 성숙, 배 발생율, 세포 수, 동결성을 검토하였다. 다음으로, 근래 혈청배지로 생산한 체외 배양 수정란은 과체중의 산자 생산, 초기 산자 사망률, caesarean section, dystocia 같은 발병으로 문제가 지적되고 있다. 그러나 무 혈청 배지로 생산한 체외 배양 수정란은 이러한 현상을 개선할 수 있다는 보고가 있어 본 실험에서는 완전 무혈청 배양액에서 생산된 동결란과 신선란을 젖소에 이식하여 그 결과를 검토하였다. 무혈청 배양액에는 에너지원과 세포성장인자가 첨가된 IVD101과 IVMD101, 대조군인 혈청 배양액에는 TCM199 + 10% FBS가 사용되었다. IVMD101에 의해 체외성숙이 이루어 졌고, 혈청이 첨가된 TCM199 + 10% FBS에서는 12.4% 배 발생율을 보인데 반해, 무혈청 배양액 IVD101과 IVMD101이 각 32.4%, 34.5%로 훨씬 높은 배 발생율을 보였다. 더욱이, 세포 수에 있어서도 무혈청 배양액에서 발생된 배반포의 세포수가 혈청이 첨가된 배양액에서 발생된 배반포의 세포수보다 월등하였으며, 이는 체내란과 비슷한 세포 수를 보이고 있다. 수정란의 내동성을 보면, 융해하고 24시간 배양기 정치 후에 IVD101과 IVMD101은 94.5%, 95.8%의 생존율을 보인 반면 TCM199 + 10% FBS는 52.5%에 불과하다. 융해하고 72시간후 탈출 배반포율이 IVD101과 IVMD101는 78.4%, 83.7%였는데 반해 TCM199 + 10% FBS는 32.0%였다. 마지막으로, 무혈청 배양액에서 발생한 동결란과 신선란을 젖소에 이식한 후에 임신율에 있어서는 유의적 차이는 없었지만, 무혈청 배지에서 생산된 수정란의 내동성의 탁월함이 증명되었다. 이러한 결과들로 종합해 보면, 무혈청 배양액 (IVD101, IVMD101)에서 발생된 수정란이 혈청 배양액에서 발생된 수정란보다 배발생율, 세포수, 동결성, 임신율에 있어서 우수함을 알 수 있었다. 이러한 무혈청 배양액은 배발생 과정의 연구뿐만 아니라 수정란 이식을 위한 고품질의 체외 수정란의 대량 생산, 복제, 형질전환 동물 생산 등에도 유익할 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제32권1호
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• pp.1-8
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• 2017

유전자원을 동결 보존하는 것은 유전적인 개량과 우수한 종축의 재생산 및 멸종 위기종의 유전자 집단을 보존하는데 있어 중요한 방법으로 알려져 있다. 그러나 동결 유전자원의 대표적인 정액은 살아 있는 종축에서 채취하여 보존하고 있는데 동결자원은 그 수가 제한되어 있어 이용에 한계가 존재하고 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 본 연구에서는 동결정액을 2가지 방법으로 융해하고 재 동결을 실시하여 그 정자의 특성을 CASA로 분석하고 생존성을 비교하였다. 일반적으로 사람의 정액은 재동결 과정을 극복하여 반복적인 동결 및 융해가 가능하다고 보고되었으나 한우 정액에 관한 재 동결 성적에 관한 연구는 자료는 찾아보기 힘들다. 본 연구에서는 칡소 2두, 흑우 1두, 백한우 2두 및 보증씨수소 1두의 동결정액을 이용하여 재 동결에 관한 연구를 실시하였으며 개체에 따라 29.7%에서 46.6%의 생존율을 얻었다. 2차 동결 방법에 있어서 생존율은 $5^{\circ}C$에서 융해하는 방법이 $37^{\circ}C$ 융해방법보다 더 높으며 변이가 낮은 것으로 관찰되었다. 그럼에도 불구하고 2가지 방법에 의한 재동결 기법은 체외 수정이나 OPU 유래 수정란 생산을 위하여 한우의 증식에 적용할 수 있을 것으로 보이며 추후 수정란 생산에 관한 연구에 도움이 될 것으로 판단된다.