• 한국식물학회:학술대회논문집
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• 한국식물학회 1996년도 제10회 식물생명공학심포지움 고등식물 발생생물학의 최근 진보
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• pp.61-74
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• 1996

Human and monogastric animals can not synthesize 10 out of the 20 amino asids and therefor need to obtain these from their diet. The plant seed is a major source of dietary protein. It is particular important in their study to increase nutritional quality of the seed storage proteins. The low contents of lysine, asparagine and threonenein various cereal seeds and of cystein and methionine. In legume seeds is due to the low proportions of these amino acids in the major storage proteins, we have tried to apply the three strategies; (1) mutagenesis and selection of specific amino acid analogue resistance, (2) cloning and expression study of lysine biosynthesis related gene, (3) transfomation of lysine rich soybean glycinin gene. The 5-methyltryptophan (5MT) resistant cell lines, SAR1, SAR2 and SAR3 were selected from anther derived callus of rice (Oryza sativa L. "Sasanishiki"). Among these selected cell lines, two (SAR1 and SAR3) were able to grow stably at 200 mg/L of 5MT. Analysis of the freed amino acids in callus shows that 5MT resistant cells (SAR3) accumulated free tryptophan at least up to 50 times higher than those that of the higher than of SAS. These results indicated that the 5MT resistant cell lines are useful in studies of amino acid biosynthesis. Tr75, a rice (Oryza sativa L., var. Sasanishiki) mutant resistant to 5MT was segregated from the progenies of its initial mutant line, TR1. The 5MT resistant of TR75 was inherited in the M8 generations as a single dominant nuclear gene. The content of free amino acids in the TR75 homozygous seeds increased approximately 1.5 to 2.0 fold compared to wild-type seeds. Especially, the contents of tryptophan, phenylalanine and aspartic acid were 5.0, 5.3 and 2.7 times higher than those of wild-type seeds, respectively. The content of lysine is significantly low in rice. The lysine is synthesized by a complex pathway that is predominantly regulated by feedback inhibition of several enzymes including asparginase, aspatate kinase, dihydrodipicolinat synthase, etc. For understanding the regulation mechanism of lysine synthesis in rice, we try to clone the lysine biosynthetic metabolism related gene, DHPS and asparaginase, from rice. We have isolated a rice DHPS genomic clone which contains an ORF of 1044 nucleotides (347 amino acids, Mr. 38, 381 daltons), an intron of 587 nucleotides and 5'and 3'-flanking regions by screening of rice genomic DNA library. Deduced amino acid sequence of mature peptide domain of GDHPS clone is highly conserved in monocot and dicot plants whereas that of transit peptide domain is extremely different depending on plant specie. Southern blot analysis indicated that GDHPS is located two copy gene in rice genome. The transcripts of a rice GDHPS were expressed in leaves and roots but not detected in callus tissues. The transcription level of GDHPS is much higher in leaves indicating enormous chloroplast development than roots. Genomic DNA clones for asparaginase genes were screened from the rice genomic library by using plaque hybridization technique. Twelve different genomic clones were isolated from first and second screening, and 8 of 12 clones were analyzed by restriction patterns and identified by Southern Blotting, Restriction enzyme digestion patterns and Southern blot analysis of 8 clones show the different pattern for asparaginase gene. Genomic Southern blot analysis from rice were done. It is estimated that rice has at least 2-3 copy of asparaginase gene. One of 8 positive clones was subcloned into the pBluescript SK(+) vector, and was constructed the physical map. For transformation of lysine rich storage protein into tobacco, soybean glycinin genes are transformed into tobacco. To examine whether glycinin could be stably accumulated in endosperm tissue, the glycinin cDNA was transcriptionally fused to an endosperm-specific promotor of the rice storage protein glutelin gene and then introduced into tobacco genomic via Agrobacterium-mediated transformation. Consequently the glycinin gene was expressed in a seed-and developmentally-specific manner in transgenic tobacco seeds. Glycinin were targeted to vacuole-derived protein bodies in the endosperm tissue and highly accumulated in the matrix region of many transgenic plant (1-4% of total seed proteins). Synthesized glycinin was processed into mature form, and assembled into a hexamer in a similar manner as the glycinin in soybean seed. Modified glycinin, in which 4 contiguous methionine residues were inserted at the variable regions corresponding to the C - teminal regions of the acidic and basic polypeptides, were also found to be accumulated similarly as in the normal glycinin. There was no apparent difference in the expression level, processing and targeting to protein bodies, or accumulation level between normal and modified glycinin. glycinin.

• 생명과학회지
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• 제17권7호통권87호
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• pp.889-895
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• 2007

KIF5는 2분자의 kinesin heavy chain (KHC)과 2분자의 kinesin light cham (KLC)으로 구성되며 미세소관과 직접 결합한다. KIF5는 여러가지 세포 내 소기관을 이동시키나 KIF5가 이동시키는 운반체가 어떻게 특이적으로 결합하는지는 아직 밝혀지지 못하였다. 본 연구에서 효모 two-hybrid system을 사용하여 KLC1의 tetratricopeptide repeats (TRP) 부위와 결합하는 세포 내의 단백질을 분리하였다. 결과 KLC1와 특이적으로 결합하는JNK/stress-activated protein kinase-associated protein 1 (JSAP1/JIP3)을 분리하였다. 이러한 결합은 KLC1의 TRP1, 2 영역과 JSAP1의 leucine zipper 영역이 결합에 관여하며, 또한 효모 two-hybrid assay에서 JSAP1은 KLC2와 결합하지만 신경세포에서 발현하는 KIF5A, KIF5C 그리고 모든 세포에서 발현하는 KIF5B와는 결합하지 않았다. 단백질간의 결합을 pull-down assay로 확인한 결과 KLC1은 glutathione S-transferase (GST)와는 결합하지 않으나 GST결한 JSAP1과는 결합하였다. 또한 생쥐의 뇌 파쇄 액으로부터 JSAP1 항체로 면역침강을 행한 결과 KLC1은 JSAP1과 같이 침강하였다. 이러한 결과들은 KLC1은 JSAP1과 결합하며, JSAP1은 KLC1의 수용체로세포 내 KIF5의 수송의 매개 단백질로 작용함을 시사한다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제33권1호
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• pp.1-9
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• 2006

도처에 분포하는 peroxiredoxins (Prxs)은 세포 내 방어신호전달 과정에서 다양한 기능을 하는 것으로 나타났다. Prxs는 크게 typical 2-Cys Prx, atypical 2-Cys Prx와 1-Cys Prx의 세 부류로 분류되는데, 이것들은 cysteine 잔기의 수와 촉매기전에 따라 구분된다. 세 종류의 단백질 중, N-말단에 peroxidatic cysteine 잔기를 포함하는 typical 2-Cys Prx는 $H_2O_2$ 분해과정 동안 과산화물-의존적인 sulfenic acid로의 산화와 thiol-의존적 환원과정이 순환되어 일어난다. Sulfenic acid는 고농도의 $H_2O_2$와 Trx, Trx reductase와 NADPH를 포함하는 촉매 요소의 존재하에 cysteine sulfenic acid로 과산화 될 수 있다 과산화된 2-Cys Prx는 ATP 의존성 효소인 sulfiredoxin의 작용에 의해 천천히 환원된다. 세포가 강력한 산화나 열 충격 스트레스에 노출되면, 2-Cys Prx는 LMW 단백질에서 HMW complex로 구조를 변화시켜 peroxidase에서 chaperone으로 기능의 전환을 일으킨다. 2-Cys Prx의 C-말단 부분 역시 이러한 구조적 전환에 중요한 역할을 한다. 따라서, C-말단이 잘려진 단백질은 과산화가 되지 않고 단백질의 구조와 기능이 조절될 수 없다. 이러한 반응들은 활성 자리인 peroxidatic cysteine 잔기에 의해 일차적으로 유도되며, 그것은 세포에서 '$H_2O_2$ sensor' 로서 작용하다. 2-Cys Prx의 가역적인 구조와 기능 변화는 세포가 외부자극에 적응하는 수단으로 작용하며, 아마도 세포내 방어신호체계를 활성화 시키는 것으로 생각된다. 특히, chloroplast에 존재하는 식물 2-Cys Prx는 촉매반응 동안 주된 구조적인 변화를 나타내는 역동적인 단백질 구조를 가지고 있어서, 산화-환원 의존적으로 super-complex를 형성하고 가역적으로 thylakoid membrane에 부착한다.

• 농업과학연구
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• 제41권2호
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• pp.85-99
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• 2014

Sulfonylurea (SU)-resistant weeds of eight annual weeds, Monochoria vaginalis, Scirpus juncoides and Cyperus difformis, etc., and four perennial weeds, Scirpus planiculmis, Sagittaria pigmaea, Eleocharis acicularis and Sagittaria trifolia as of 2013 since identification Monochoria korsakowii in the reclaimed rice field in 1998. And the resistant Echinochloa oryzoides to ACCase and ALS inhibitors has been confirmed in rice fields of the southern province, Korea in 2009. In the beginning, the M. vaginalis, S. juncoides and C. difformis of these SU-resistant weeds were rapidly and individually spreaded in different fields, however, these resistant weeds have been occurring simultaneously in the same filed recently. The resistant biotype by weed species demonstrated about 10-to 1,000-fold resistance, based on $GR_{50}$ values of the SU herbicides tested. And the resistant biotype of E. oryzoides to cyhalofop-butyl, pyriminobac-methyl, and penoxsulam was about 14, 8, and 11 times more resistant than the susceptible biotype base on $GR_{50}$ values. The products and applied area of SU-included herbicides have been increased rapidly, and have accounted for about 69% and 96% in Korea, respectively. In Korea, the main cause of SU-resistant weed is extensive use of these herbicides. The top ten herbicides by applied area were composed of all SU-included herbicides by 2003. The concentrated and successive treatment of ACCase and ALS inhibitors for control of barnyardgrass in rice led up to the resistance of E. oryzoides. Also, SU-herbicides like pyrazosulfuron-ethyl and imazosulfuron which effective to barnyardgrass can be bound up with the resistance of E. oryzoides. The ALS activity isolated from the resistant biotype of M. korsakowii to SU-herbicides tested was less sensitive than that of susceptible biotype. The concentration of herbicide required for 50% inhibition of ALS activity ($I_{50}$) of the SU-resistant M. korsakowii was 14-to 76-fold higher as compared to the susceptible biotype. No differences were observed in the rates of [$^{14}C$]bensulfuron uptake and translocation. Acetolactate synthase (ALS) genes from M. vaginalis resistant and susceptible biotypes against SU-herbicides revealed a single amino acid substitution of proline (CCT), at 197th position based on the M. korsakowii ALS sequence numbering, to serin (TCT) in conserved domain A of the gene. Carfentrazone-ethyl and pyrazolate were used mainly to control SU-resistant M. vaginalis by 2006 in Korea. However, the alternative herbicides such as benzobicyclone, to be possible to control simultaneously the several resistant weeds, have been developing and using broadly, because the several resistant weeds have been occurring simultaneously in the same fieled. The top ten herbicides by applied area in Korea have been occupied by products of 3-way mixture type including herbicides with alternative mode of action for the herbicide resistant weeds. Mefenacet, fentrazamide and cafenstrole had excellent controlling effects on the ACCase and ALS inhibitors resistant when they were applied within 2nd leaf stage.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제45권1호
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• pp.63-70
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• 2017

독도 해저 2,000 미터 퇴적토를 이용한 메타게놈 유전자 은행의 60,672 클론을 기름 성분 tributyrin이 첨가된 배지에서 스크리닝 하였다. 활성을 가진 클론에서 EstES1 유전자를 선발하였다. EstES1은 553개 아미노산으로 구성된 분자량 59.4 kDa 단백질로, 가장 높은 유사성은 Haliangium ochraceum의 carboxylesterase와 44%이었다. EstES1 서열 내부에는 carboxylesterase의 전형적인 penta-peptide motif, catalytic triad 및 N-terminal 부위 37개의 leader sequence가 존재했다. 서열기반 계통분석 결과, EstES1은 신규한 esterase 임을 보여주었다. EstES1 효소의 leader 서열을 제거한 재조합 수용성 RLES1 효소는 탄소 2-12까지 포함된 long acyl ethyl ester 기질을 모두 이용할 수 있지만, p-Nitrophenyl butyrate (C4)에 가장 높은 활성과 turn-over 값을 보였다. 최적 활성은 $45^{\circ}C$, pH 9.0이다(specific activity 255.4 U/mg). 또한 강알칼리 상태인 pH 10.5까지 80% 이상의 활성이 유지되었다. EstES1의 활성은 $60^{\circ}C$에서 내열성을 보여, 1시간 동안 활성을 100% 유지할 수 있다. 효소 활성은 여러 종류의 유기용매 하에서도 안정하게 유지되었다. 따라서, EstES1은 배양이 불가능한 난배양 미생물로부터 유래된 신종 효소 유전자로서, 고온의 지방산 가수분해, 알칼리 상태나유기용매가 존재하는 여러 공정분야에 활용될 수 있다.

• 생명과학회지
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• 제17권12호
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• pp.1641-1648
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• 2007

Yippee 패밀리를 구성하는 yippee-유사 단백질들은 한 개의 zinc-finger 도메인을 지닌 Drosophila yippee 단백질의 homolog로서 모든 진핵생물에 존재하는 것으로 알려졌으나 그 기능은 밝혀진 바가 없다. 인체 T 림프구의 활성화과정 중 발현수준이 변화하는 유전자들을 선별하기 위해 인체 말초혈액에서 분리한 resting T 세포, immobilized anti-CD3에 의해 26시간 혹은 30시간 동안 활성화시킨 T 세포로부터 각각 정제한 total RNA를 이용하여 ODD-PCR을 수행한 결과, resting T 세포에서는 발현되지만 immobilized anti-CD3 활성화에 의해 세포주기를 개시하여 $G_1/S$ boundary에 도달한 T 세포들로부터는 전혀 발현되지 않는 흥미로운 유전자로서 Drosophila yippee 단백질 유전자의 인체 homolog인 YPEL5 유전자를 분리하였다. 노던 블로팅법으로 T 세포 활성화에 뒤이은 YPEL5 mRNA의 발현 변화를 조사한 결과, ${\sim}2.2kb$ 크기의 YPEL5 mRNA는 resting T 세포를 비롯하여 immobilize anti-CD3에 의한 활성화 후 1.5시간까지는 확인되었으나 활성화 후 5시간 이후부터 48시간에 이르는 시간에는 전혀 확인되지 않았다. YPEL5 단백질을 GFP-fusion 단백질로서 인체 암세포주인 HeLa 세포에 transfection하여 발현시킨 결과, GFP-YPEL5 단백질이 모두 핵에 위치하는 것으로 나타나 YPEL5 단백질이 핵단백질임을 확인하였다. 또한 YPEL5의 기능을 규명하기 위해 YPEL5 발현벡터를 HeLa 세포에 transfection 하고 발현시켜 HeLa 세포의 증식에 미치는 YPEL5의 영향을 MTT assay로 분석한 결과, vector plasmid를 transfection시킨 대조구의 47% 수준으로 세포증식이 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 YPEL5 mRNA의 발현이 T 세포 수용체를 통한 T 세포 활성화의 초기단계에 현저히 감소됨을 보여주며, 또한 YPEL5가 핵단백질로서 세포증식에 대해 저해효과를 미칠 수 있음을 시사한다.

• 한국잡초학회지
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• 제31권2호
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• pp.119-133
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• 2011

2010년까지 국내 논에서 설포닐우레아(sulfonylurea : SU)계 제초제들에 대한저항성잡초로 확인된 잡초들 1998년도에 충남서산 간척지 논에서 물옥잠이 확인이후 일년생 물달개비, 올챙이고랭이, 알방동사니 등 7초종, 다년생 올미, 새섬매자기 등 다년생 잡초 3초종이 발생하여 총 10초종이다. 그리고 2009년 ACCase 및 ALS 저해제들에 대한 저항성 피가 담수직파 논의 서 남부지역에서 처음 확인되었다. 초기에는 SU계 제초제들에 대한 저항성잡초들인 물달개비, 올챙이고랭이, 알방동사니 등은 하나의 논 필지에 하나의 초종들이 발생을 하였으나 최근에는 하나의 필지에 다수의 초종들이 동시적으로 발생하고 있다. 2008년도에 전국 861필지의 논에서 채취한 토양에서 발생하고 있는 물달개비 및 올챙이고랭이의 저항성 비율은 각각 42% 및 23%로 나타났다. 저항성잡초들의 생체중을 50% 억제한 농도($GR_{50}$)는 저항성 계통이 감수성 계통에 비해 수 십배에서 수 천배 높게 나타났다. ACCase 및 ALS 저해 제초제들인 cyhalofopbutyl, pyriminobac-methyl, penoxsulam 저항성 강피에 대한 저항성 계통의 $GR_{50}$은 감수성 계통에 비해 각각 14, 8, 11배나 높게 나타났다. 한국의 논에서 제초제 저항성의 다발생과 확산의 원인은 크게 잡초측면과 제초제 측면으로 구분할 수 있다. 잡초측면에서는 종자생산량과 발아율이 높은 잡초들 즉 물달개비, 올챙이고랭이 등이 저항성잡초로 변화한다. 그리고 제초제 측면은 저항성잡초 유발의 원인인 선택성이 탁월하고 약효지속성이 매우 긴 SU계 제초제들의 광범위한 사용이다. SU계 제초제들의 생산 품목들과 처리 논 면적의 비율은 각각 69%와 96%이다. 그리고 2003년까지 처리면적으로 본 선호도 10위까지 제초제들은 대부분 SU계 제초제들이 혼합된 "일발처리제"들이다. 직파재배 논에서 ACCase 및 ALS들이 혼합된 제초제들의 연용은 제초제 저항성 피를 유발하였고, 이는 피에 효과적인 SU계 제초제들인 pyrazosulfuron-ethyl 및 imazosulfuron과 무관하지 않다. SU계 제초제들에 대한 물옥잠의 저항성 계통의 $I_{50}$은 감수성 계통에 비해서 14배에서 76배 높았는데, 이는 제초제의 흡수 및 이행에 의한 차이보다는 ALS 유전자의 점 돌연변이(point mutation)에 의한 것으로 나타났다. 즉 ALS 유전자 아미노산 197번째 proline이 serine로 변화되었기 때문이다. 제초제 저항성잡초 방제로 benzobicyclone, bromobutide 등은 광엽 및 방동사니과 잡초들을 동시에 방제가 가능하다. 그리고 ACCase 및 ALS 저항성 피의 방제는 mefenacet, fentrazamide, cafenstrole로 2엽기까지 방제가 가능하다. 그러나 앞으로 국내 논에서 제초제 저항성잡초 및 관리에 대해서는 많은 문제점들을 내포하고 있다. 첫째, 현재까지 제초제 저항성 유발 약제들인 ALS 및 ACCase 저해제들의 사용량이 증가하기 때문에 제초제 저항성 잡초들은 계속 발생할 뿐만 아니라 더욱 빠른 속도로 확산할 것이다. 둘째, 미국, 유럽, 호주 등 선진국들과 같은 제초제 저항성잡초를 연구할 수 있는 전문 연구기관과 인력이 부족하다.