Plant-derived triterpenoids commonly possesses biological properties such as anti-inflammatory, antimicrobial, anti-viral and anti-cancer. Luvunga scandens is one of the plant that produced triterpenoids. The aims of the study was to analyze cell cycle profile and to determine the expression of p53 unregulated modulator of apoptosis (PUMA), caspase-8 and caspase-9 genes at mRNA level in MCF-7 cell line treated with two triterpenoids, flindissol (1) and 3-oxotirucalla-7,24-dien-21-oic-acid (2) isolated from L. scandens. The compounds were tested for cell cycle analysis using flow cytometer and mRNA expression level using quantitative RT-PCR. The number of MCF-7 cells population which distributed in Sub G1 phase after treated with compound 1 and 2 were 7.7 and 9.3% respectively. The evaluation of the expression of genes showed that both compounds exhibited high level of expression of PUMA, caspase-8 and caspase-9 as normalized to ${\beta}-actin$ via activation of those genes. In summary, the isolated compounds of L. scandens plant showed promising anticancer properties in MCF-7 cell lines.
Park, Kyoung-Sook;Yi, So-Yeon;Kim, Un-Lyoung;Lee, Chang-Soo;Chung, Jin-Woong;Chung, Sang-J.;Kim, Moon-Il
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제19권9호
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pp.911-917
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2009
The apoptotic caspases have been classified in accordance with their substrate specificities, as the optimal tetrapeptide recognition motifs for a variety of caspases have been determined via positional scanning substrate combinatorial library technology. Here, we focused on two proteolytic recognition motifs, DEVD and IETD, owing to their extensive use in cell death assay. Although DEVE and IETD have been generally considered to be selective for caspase-3 and -8, respectively, the proteolytic cleavage of these substrates does not display absolute specificity for a particular caspase. Thus, we attempted to monitor the cleavage preference for caspase-3, particularly using the recombinant protein substrates. For this aim, the chimeric GST:DEVD:EGFP and GST:IETD:EGFP proteins were genetically constructed by linking GST and EGFP with the linkers harboring DEVD and IETD. To our best knowledge, this work constitutes the first application for the monitoring of cleavage preference employing the recombinant protein substrates that simultaneously allow for mass and fluorescence analyses. Consequently, GST:IETD:EGFP was cleaved partially in response to caspase-3, whereas GST:DEVD:EGFP was completely proteolyzed, indicating that GST:DEVD:EGFP is a better substrate than GST:IETD:EGFP for caspase-3. Collectively, using these chimeric protein substrates, we have successfully evaluated the feasibility of the recombinant protein substrate for applicability to the monitoring of cleavage preference for caspase-3.
Mori Cortex Radicis is distributed in Northwestern China, northern Asia, northern Europe, North America, and Korea. This extracts drops sugar in bloods and inhibits cyclic AMP phophodiesterase. In this study, we investigated whether Mori Cortex Radicis would cause apoptotic death of A549 lung cancer cells. To examine the apoptotic effect of Mori Cortex Radicis, cytotoxicity assay, DNA fragmentation analysis, caspase-3 activity assay, and Western blotting for caspase-3, caspase-9 and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) and cytochrome c were performed. Treatment of cells with Mori Cortex Radicis was shown to induce cell death in a dose-dependent manner. DNA fragmentation was made in response to Mori Cortex Radicis. The active fragments of caspase-3, caspase-9 and PARP were almost completely induced and cytochrome c was released following exposure to Mori Cortex Radicis. To elucidate the apoptotic mechanisms, RT-PCR and Western blot analyses for the expression of Bcl-2, Bu and Cox-2 were carried out. Treatment with Mori Cortex Radicis was expressed the reduction of Bcl-2 and Cox-2 and the induction of Bax. Especially p21 and p53 were increased prior to untreated control, while cyclin E and cyclin D1 decreased in the cytosol. These results suggest that the effect Mori Cortex Radicis is associated with the cell cycle arrest and pro-apoptotic cell death in A549 lung cancer cells.
목적 : 이 연구는 Vipera lebetina turanica의 사독약침액(蛇毒藥鍼液)(Snake venom toxin, SVT)이 인간 신경아세포종의 암세포주인 SK-N-MC 세포에서 암세포성장의 억제 및 그 기전에 대하여 살펴보고자 하였다. 방법 : SVT를 처리한 후 SK-N-MC의 성장억제를 관찰하기 위해 CCK-8 assay와 LDH assay를 시행하였고, apoptosis 평가에는 세포형태의 관찰과 DAPI, TUNEL, Annexin V-PI double staining assay 및 cell detachment assay를 시행하였다. 세포자멸사 관련 세포기전을 보기 위하여 세포주기, 세포내 칼슘량, 세포내 활성산소량 및 미토콘드리아의 세포막전위 변화를 측정하였고, DNA fragmentation assay를 시행하였으며, 세포자멸사 조절 단백인 Bax, Bcl-2, caspase-3, -9의 발현 변화 관찰에는 western blot analysis를 시행하였다. 결과 : SK-N-MC 세포에 SVT를 처리한 후, 신경아세포종 세포의 성장, Apoptosis의 유발 및 기전에 영향을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. SVT를 처리한 SK-N-MC 세포 관찰에서 $20{\mu}g/m{\ell}$ SVT 처리가 암세포성장의 유의한 억제를 나타내었다. 세포독성 관찰에서 SVT처리는 처리하지 않은 것에 비하여 증가를 나타내었다. 2. 세포자멸사 평가에서 SVT를 처리한 SK-N-MC 세포는 세포자멸사의 특징적 형태를 나타내었다. TUNEL assay에서는 세포자멸사 활성세포가 미약하게 나타난 반면 cell detachment assay와 Annexin V-PI double staining에서는 각각 세포박리와 세포자멸사 활성세포의 유의한 증가를 나타내었다. 3. 세포자멸사 관련 세포기전연구에서 SVT를 처리한 SK-N-MC 세포의 세포주기, 세포내 칼슘량 및 DNA fragmentation에는 유의한 변화가 관찰되지 않은 반면 세포내 활성산소 양은 유의한 증가를 나타내었고, 그에 따른 미토콘드리아 세포막 전위의 유의한 변동이 관찰되었다. 4. SVT를 처리한 SK-N-MC는 세포자멸사 관련 단백 발현에서 caspase-9에 대해 유의한 증가를 나타내지 않았으나 Bax 및 caspase-3의 유의한 증가와 Bcl-2의 유의한 감소를 나타내었다. 결론 : 이상의 결과는 SVT가 세포내 활성산소를 증가시키므로 미토콘드리아의 세포막전위에 변화를 일으켜 인간 신경아세포종 세포주인 SK-N-MC의 세포박리와 유관한 세포자멸사를 유발하므로 증식억제 효과가 있음을 입증한 것이다.
예로부터 한국, 일본 및 중국에서 민간처방 약재 및 건강식품으로 사용되어온 매실은 다양한 효능을 가지는 것으로 알려져 있으나 인체 암세포에서 유발하는 항암작용 및 그에 따른 분자생물학적 기작에 대해서는 명확히 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 인체 혈구암 U937 세포에서 매실의 메탄올 추출물(MEPM)이 유발하는 항암효과 및 항암기전을 조사한 결과, MEPM 처리 농도 의존적으로 암세포의 성장억제 및 apoptosis를 유발하는 것으로 나타났다. MEPM에 의해서 유발되는 apoptosis에는 XIAP 및 survivin 등과 같은 IAP family의 발현 감소와 더불어 FasL의 발현 증가, Bcl-2의 발현 감소 및 Bid의 단편화 현상이 관여하는 것으로 나타났으며, 두 가지 apoptosis 유발 개시 및 최종 apoptosis 단계에서 중요한 역할을 하는 caspase-8과 -9 및 -3의 활성화와 그에 따른 다양한 기질단백질의 발현 감소 및 단편화가 동반되었음을 알 수 있었다. 또한 인위적인 caspase-3의 활성 차단으로 MEPM에 의하여 유발되는 apoptosis가 현저하게 억제되는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 MEPM은 암세포의 chemotherapeutic agent로서의 가능성을 확인하였지만 향후 지속적인 연구를 통하여 활성물질의 동정 및 관련 기전의 비교 등이 지속적으로 이루어져야 할 것으로 생각된다.
Background: Crocus sativus and its major constituent crocin are well established to have anti-cancer properties in breast cancer cells (MCF-7). However the role of C. sativus extract (CSE) and crocin on caspase signaling mediated MCF-7 cell death at molecular level is remains unclear. In this study, we tried to unravel role of CSE and crocin on caspase mediated MCF-7 cells death and their in vivo preclinical toxicity profiling and immune stimulatory effect. Materials and Methods: CSE extract was fractionated by HPLC and crocin was isolated and characterized by NMR, IR, and MS. MCF-7 cells were treated with both CSE and crocin and expression of Bcl-2 and Bax was assessed after 24 and 36 hours. Furthermore, caspase 3, caspase 8 and caspase 9 expression was determined by Western blotting after 24 hours of treatment. DNA fragmentation analysis was performed for genotoxicity of CSE and crocin in MCF-7 cells. The in vivo toxicity profile of CSE (300 mg/kg of b.wt) was investigated in normal Swiss albino mice. In addition, peritoneal macrophages were collected from crocin (1, 1.5 and 2 mg/kg body weight) treated mice and analyzed for ex vivo yeast phagocytosis. Results: Immunoblot analysis revealed that there was time dependent decline in anti-apoptotic Bcl-2 with simultaneous upregulation of Bax in CSE and crocin treated MCF-7 cells. Further CSE and crocin treatment downregulated caspase 8 and 9 and cleaved the caspase 3 after 24 hours. Both CSE and crocin elicited considerable DNA damage in MCF-7 cells at each concentration tested. In vivo toxicity profile by histological studies revealed no observable histopathologic differences in the liver, kidney, spleen, lungs and heart in CSE treated and untreated groups. Crocin treatment elicited significant dose and time dependent ex vivo yeast phagocytosis by peritoneal macrophages. Conclusions: Our study delineated involvement of pro-apoptotic and caspase mediated MCF-7 cell death by CSE and crocin at the molecular level accompanied with extensive DNA damage. Further we found that normal swiss albino mice can tolerate the maximum dose of CSE. Crocin enhanced ex vivo macrophage yeast phagocytic ability.
The objective of this study was to compare the effects of a combined treatment consisting of an isoflavone diet and aerobic exercise on the Caspase 9 levels, and Bcl-2 levels during menopause, using 30 S.D ovariectomized rats as a model, over 12 weeks. The ovariectomized rats were divided into 4 experiment groups, with 8 rats in each group, as follows: (1) General diet group (GD, n=8), (2) Isoflavone diet group (ID, n=8), (3) General diet + Exercise group (GEX, n=8), (4) Isoflavone diet + Exercise group (IEX, n=8). The findings of this study were as follows: 1. Combined treatment consisting of an isoflavone diet and regular exercise resulted in a significant reduction in the expression of caspase-9 proteins (p<0.05), and a significant increase in the expression of Bcl-2 proteins (P<0.001). In addition, apoptotic cells were more decreased (p<0.001) in GEX and IEX group. This also suggests that cardiovascular disease in postmenopausal women might be prevented or inhibited to exert positive apoptotic inhibitory effects by increasing Bcl-2 protein expression within aortic tissues during vascular movement and decrease caspase-9 protein.
The purpose of this study was to investigate the effect of Imyosan on apoptosis in human colorectal cancer HCT116 cells. Phellodendron amurense Rupr. and Atratylodes lancea D.C. compose Imyosan. First of all, to study the cytotoxic effect of methanol extract of Imyosan (IMS-MeOH) on HCT116 cells, the cells were treated with various concentrations of IMS-MeOH and then cell viability was determined by XTT reduction method. IMS-MeOH reduced viability of HCT116 cells in a dose and time-dependent manner. To confirm the induction of apoptosis, the c1eavage of poly ADP-ribose polymerase (PARP), a substrate for caspase-3 and a typical sign of apoptosis, and the activation of caspase-3, procaspase-8 and procaspase-9 were examined by western blot analysis. IMS-MeOH decreased procaspase-3, procaspase-8 and procaspase-9 levels in a dose-dependent manner and induced the clevage of PARP. IMS-MeOH triggered the mitochondrial apoptotic signaling by increasing the release of cytochrome c from mitochondria to cytosol. Furthermore, IMS-MeOH also downregulated the anti-apoptotic Bcl-2 and upregulated the pro-apoptotic-Bax. Therefore, these results suggest that IMS-MeOH induced HCT1l6 cell death through the mitochondrial pathway. To explore whether the activities of caspases was required for induction of apoptosis by IMS-MeOH, caspase-3, -8, -9 activity measured by using substrates, respectively. IMS-MeOH increased caspase-3, -8, -9 activity. Co-treatment with inhibitors of caspase-3, -8, -9 and IMS-MeOH significantly blocked IMS-MeOH-triggered apoptosis in HCT1l6 cells. These results suggest that IMS-MeOH induces caspases-mediated apoptosis.
Park, Cheol;Park, Sejin;Chung, Yoon Ho;Kim, Gi-Young;Choi, Young Whan;Kim, Byung Woo;Choi, Yung Hyun
Nutrition Research and Practice
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제8권2호
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pp.132-137
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2014
BACKGROUND/OBJECTIVES: In this study, the apoptogenic activity and mechanisms of cell death induced by hexane extract of aged black garlic (HEABG) were investigated in human leukemic U937 cells. MATERIALS/METHODS: Cytotoxicity was evaluated by MTT (3-(4, 5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazoliumbromide) assay. Apoptosis was detected using 4,6-diamidino-2-phenyllindile (DAPI) staining, agarose gel electrophoresis and flow cytometry. The protein levels were determined by Western blot analysis. Caspase activity was measured using a colorimetric assay. RESULTS: Exposure to HEABG was found to result in a concentration- and time-dependent growth inhibition by induction of apoptosis, which was associated with an up-regulation of death receptor 4 and Fas legend, and an increase in the ratio of Bax/Bcl-2 protein expression. Apoptosis-inducing concentrations of HEABG induced the activation of caspase-9, an initiator caspase of the mitochodrial mediated intrinsic pathway, and caspase-3, accompanied by proteolytic degradation of poly(ADP-ribose)-polymerase. HEABG also induced apoptosis via a death receptor mediated extrinsic pathway by caspase-8 activation, resulting in the truncation of Bid, and suggesting the existence of cross-talk between the extrinsic and intrinsic pathways. However, pre-treatment of U937 cells with the caspase-3 inhibitor, z-DEVD-fmk, significantly blocked the HEABG-induced apoptosis of these cells, and increased the survival rate of HEABG-treated cells, confirming that HEABG-induced apoptosis is mediated through activation of caspase cascade. CONCLUSIONS: Based on the overall results, we suggest that HEABG reduces leukemic cell growth by inducing caspase-dependent apoptosis through both intrinsic and extrinsic pathways, implying its potential therapeutic value in the treatment of leukemia.
Effect of the depletion or oxidation of GSH on mitomycin c (MMC)-induced mitochondrial damage and cell death was assessed in small cell lung cancer (SCLC) cells. MMC induced cell death and the decrease in the GSH contents in SCLC cells, which were inhibited by z-LEHD.fmk (a cell permeable inhibitor of caspase-9), z-DQMD.fmk (a cell permeable inhibitor of caspase-3) and thiol compound, N-acetylcysteine. MMC caused nuclear damage, release of cytochrome c and activation of caspase-3, which were reduced by N-acetylcysteine. The depletion of GSH due to L-butionine-sulfoximine enhanced the MMC-induced cell death and formation of reactive oxygen species in SCLC cells, whereas the oxidation of GSH due to diamide or $NH_2Cl$ did not affect cytotoxicity of MMC. The results show that MMC may cause cell death in SCLC cells by inducing mitochondrial dysfunction, leading to activation of caspase-9 and -3. The MMC-induced change in the mitochondrial membrane permeability, followed by cell death, in SCLC cells may be significantly enhanced by the depletion of GSH. In contrast, the oxidation of GSH may not affect cytotoxicity of MMC.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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