• 한국미생물·생명공학회지
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• 제34권3호
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• pp.211-215
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• 2006

S. lividans에서 클로닝된 조절유전자인 afsR2를 과발현시 나타나는 up-regulated protein과 down-regulated protein 관련 유전자들을 proteomics 방법으로 선별하였고[3], 이를 방선균 발현벡터인 pSE34를 이용하여 제작된 pPNP, pGPD를 S. avermitilis에 형질전환시켜 avermectin 및 이차대사산물의 생산량 차이를 비교 분석하였다. 그 결과 up-regulated protein으로 예상되던 PNP는 wild-type S. avermitilis에서만 제한적으로 avermetin-type 대사산물의 생산성 향상을 촉진시켰으며, 이와 반대로 down-regulated protein으로 예상되었던 GPD는 avermectin-type 대사산물의 생산량을 wild type S. avermitilis에서는 4배, over-producer S. avermitilis에서는 2.5배 증가시켰다. 본 연구결과는, 방선균 조절 단백질들이 이차대사산물의 종류 및 생합성 기작에 따라 전혀 다르게 작용될 수 있음을 암시하며, 향후 이들 조절 단백질들에 대한 보다 구체적인 분자수준에서의 연구 필요성을 제시하고 있다.

• KSBB Journal
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• 제24권3호
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• pp.259-266
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• 2009

AfsR2 과발현 S. lividans TK21을 이용하여 DNA microarray를 수행하였다. 그 결과, phosphate starvation과 관련 있는 42개의 유전자들이 up-regulated 되었으며, 특히 SCO4139 (pstB, phosphate ABC transport system ATP-binding protein)와 SCO4142 (pstS, phosphate-binding protein precursor)는 afsR2가 phosphate와 같은 nutrient starvation에 적극적으로 관여한다는 것을 나타내며, SCO4228 (putative phosphate transport system regulatory protein)은 기존에 수행되었던 2D-electrophoresis 연구나 afsS null S. coelicolor를 이용한 DNA microarray 연구에서도 공통적으로 보고되었던 유전자로서 phosphate lilitation에 대한 afsR2의 효과가 지속적으로 검증되고 있음을 뜻한다. 또한 afsR2 과발현을 통해서 sigma factor인 SCO2954 (sigL)과 SCO5147 (sigE)의 발현이 유도되었으며 두 유전자의 구조적인 특징을 고려해 보았을 때 afsR2가 RNA polymerase와의 linker로서의 역할을 추측해 볼 수 있다. 뿐만 아니라 whi 관련 유전자들의 발현 또한 afsR2에 의해 증가되었다. 이는 afsR2가 단순히 2차 대사물질 생합성 조절에만 관여하는 것이 아니라 형태적 분화에 작용함으로써 최종적으로 여러 2차 대사물질의 합성을 유도한다고 말할 수 있다. 이러한 결과들을 토대로 afsR2가 기존에 항생제 생합성에만 관여하는 global regulatory 조절인자가 아닌 방선균이 stationary phase로 전환되는 시점에서 형태적 분화에 영향을 미치고 phosphate limitation stress를 줄여주는 2차 대사의 key-factor regulatory 유전자임을 알 수 있다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2005년도 생물공학의 동향(XVI)
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• pp.327-333
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• 2005

Dihydroxy-acid dehydratase (DHAD, 2,3-dihydroxy-acid hydrolyase, EC 4.2.1.9) is one of the key enzymes involved in the biosynthetic pathway of the branched chain amino acid isoleucine and valine. Although the enzyme have been purified and characterized in various mesophiles including bacteria and eukarya, the biochemical properties of DHAD has bee not yet reported from hyperthermophilic archaea. In this study, we cloned, expressed, and purified a DHAD homologue from the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus solfataricus P2, which grows optimally at $80\;^{\circ}C$ and pH 3, in E. coli. Characterization of the recombinant S. solfataricus DHAD (rSso_DHAD) revealed that it is the dimeric protein with a subunit molecular weight of 64,000 Da in native structure. rDHAD showed the highest activity toward 2,3-dihydroxyisovaleric acid among 17 aldonic acid substrates Interestingly, this enzyme also displayed 50 % activities toward some pentonic acids and hexonic acids when compared with the activity of this enzyme to the natural substrate. Moreover, rSso_DHAD indicated relatively higher activity toward D-gluconate than any other hexonic acids tested in substrates. $K_m$ and $V_{max}$ values of rSso_DHAD were calculated as $0.54\;{\pm}\;0.04\;mM$ toward 2,3dihydroxyisovalerate and $2.42\;{\pm}\;0.19\;mM$ toward D-gluconate, and as $21.6\;{\pm}\;0.4\;U/mg$ toward 2,3-dihydroxyisovalerate and $13.8\;{\pm}\;0.4\;U/mg$ toward D-gluconate, respectively. In the study for biochemical properties, the enzyme shows maximal activity between $70^{\circ}C$ and $80^{\circ}C$, and the pH range of pH 7.5 to 8.5. The half life time at $80^{\circ}C$ was 30 min. A divalent metal ion, $Mn^{2+}$, was only powerful activators, whereas other metal ions made the enzyme activity reduced. $Hg^{2+}$, organic mercury, and EDTA also strongly inhibited enzyme activities. Particularly, the rSso_DHAD activity was very stable under aerobic condition although the counterparts reported from mesophiles had been deactivated by oxygen.

• Molecules and Cells
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• 제26권6호
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• pp.536-547
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• 2008

Anthocyanidin synthase (ANS, leucoanthocyanidin oxygenase), a 2-oxoglutarate iron-dependent oxygenase, catalyzed the penultimate step in the biosynthesis of the anthocyanin class of flavonoids, from the colorless leucoanthocyanidins to the colored anthocyanidins. The full-length cDNA and genomic DNA sequences of ANS gene (designated as GbANS) were isolated from Ginkgo biloba for the first time. The full-length cDNA of GbANS contained a 1062-bp open reading frame (ORF) encoding a 354-amino-acid protein. The genomic DNA analysis showed that GbANS gene had three exons and two introns. The deduced GbANS protein showed high identities to other plant ANSs. The conserved amino acids (H-X-D) ligating ferrous iron and residues (R-X-S) participating in 2-oxoglutarate binding were found in GbANS at the similar positions like other ANSs. Southern blot analysis indicated that GbANS belonged to a multi-gene family. The expression analysis by real-time PCR showed that GbANS expressed in a tissue-specific manner in G. biloba. GbANS was also found to be up-regulated by all of the six tested abiotic stresses, UV-B, abscisic acid, sucrose, salicylic acid, cold and ethylene, consistent with the promoter region analysis of GbANS. The recombinant protein was successfully expressed in E. coli strain with pET-28a vector. The in vitro enzyme activity assay by HPLC indicated that recombinant GbANS protein could catalyze the formation the cyanidin from leucocyanidin and conversion of dihydroquercetin to quercetin, suggesting GbANS is a bifunctional enzyme within the anthocyanidin and flavonol biosynthetic pathway.

• 한국육종학회지
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• 제50권4호
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• pp.351-363
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• 2018

관상용 화훼작물에 있어서 꽃의 색깔과 형태는 중요한 형질 중 하나이다. 일반적으로 꽃색은 카로티노이드, 플라보노이드, 베타라인에 의해 결정된다. 그 중 플라보노이드는 보다 넓은 영역의 색을 나타낸다. 국화는 세계적으로 인기가 많은 관상용 화훼작물이며 꽃색을 바꾸기 위한 많은 연구가 진행되어 왔다. 국화의 경우, 시아니딘 계열 안토시아닌의 축적으로 분홍색 혹은 빨간색의 꽃색을 나타내며, 카로티노이드 계열 색소물질의 축적으로 노란색 또는 초록색의 꽃색을 나타낸다. 그러나 자연계에는 파란 꽃색의 국화는 존재하지 않는다. 지금까지 플라보노이드계 물질 생합성을 조절함으로써 파란색 꽃을 개발하기 위한 여러 연구가 시도되었다. 반면 그 외의 플라보노이드계 물질을 기반으로 한 새로운 꽃색 국화 개발연구는 거의 수행되지 않았다. 플라보노이드 생합성 조절에는 다양한 전사인자들이 관여하고 플라보노이드계 물질 기반 꽃색 변경을 위해서는 구조 유전자 및 전사인자들을 이해하는 것이 중요하다. 따라서 본 논문에서는 화훼작물의 플라보노이드 생합성 및 조절에 대하여 전반적으로 서술하였고, 그 동안 보고된 플라보노이드계 물질의 꽃색 변경 연구들을 검토하였다. 이러한 결과들은 생명공학기술을 기반으로한 국화 꽃색 변경 달성을 위한 중요한 길잡이가 될 수 있을 것이다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제12권1호
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• pp.121-129
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• 2002

Using recombinant Chinese hamster ovary (CHO) cells, strategies for developing high producers for the recombinant human Transforming Growth $Factor-{\beta}1$ ($TGF-{\beta}1$) protein are proposed and their physiological characteristics in cell cultures were investigated. $TGF-{\beta}1$ is a pleiotrophic polypeptide involved in various biological activities, including cell growth, differentiation, and deposition of extracellular matrix proteins. The CHO cells included human $TGF-{\beta}1$ cDNA in conjunction with a dihydrofolate reductase (DHFR) gene, which was cotransfected into the cells to amplify the transfected $TGF-{\beta}1$ cDNA. As a first-round screening of the transfected cells, a relatively high $TGF-{\beta}1$-producing cell line was selected, and then, it acquired a resistance to increasing concentrations of methotrexate (MTX) up to $60{\mu}M$,resulting in a significant improvement in its $TGF-{\beta}1$ biosynthetic ability. After applying a monoclonal selection strategy to the MTX-resistant cells, more productive cells were screened, including the APP-3, App-5, and App-8 cell lines. These high producers were compared with two other cell lines (AP-l cell line without amplification of transfected $TGF-{\beta}1$ cDNA and nontransfectant of $TGF-{\beta}1$ cDNA) in terms of cell growth, $TGF-{\beta}1$ productivity, sugar uptake, and byproduct formation, in the presence or absence of MTX in the culture medium. Consequently, both monoclonal selection as well as an investigation of the physiological characteristics were found to be needed for the efficient screening of higher $TGF-{\beta}1$ producers, even after the transfection and amplification of the transfected gene.

• 생명과학회지
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• 제27권6호
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• pp.726-737
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• 2017

Carotenoid는 isoprenoid 화합물로써 3-15개의 이중 결합이 결합된 긴 polyene 구조를 가지며, 이러한 구조적 특성에 의해 최대 흡수파장대가 결정된다. 카로티노이드는 전형적으로 $C_{40}$ 탄화수소 골격으로 이루어져 있으며, 그 중에는 산소를 포함하고 있는 작용기로 인해 cyclic 또는 acyclic의 크산토필을 형성하기도 한다. 현재 대부분의 세계 시장을 점유하고 있는 합성 카로티노이드의 대안을 찾기 위해 천연물(식물, 미생물, 갑각류 부산물) 유래의 카로티노이드를 생산 및 활용하기 위한 연구가 진행되고 있다. 그럼에도 불구하고, 오직 몇몇 카로티노이드(${\beta}-carotene$, lycopene, astaxanthin, canthaxanthin, lutein)만이 천연물 소재에서 분리 또는 발효되어 상업적으로 이용된다. 카로티노이드가 만성질환 예방 및 발암 억제 작용에 효과가 있음이 밝혀지면서 카로티노이드 시장이 급격히 증가하였다. 사료, 기능성 식품 및 의약품 소재로써의 카로티노이드의 중요성이 증가함에 따라 카로티노이드 생산법에 대한 연구가 진행되었으며, 이러한 관점에서 미생물 및 식물을 이용한 대사공학적 접근법에 의한 카로티노이드 대량생산법을 개발하게 되었다. 본 논문에서는 생산 균주, 대사공학 적용에 따른 대량 생산 방법, 생물학적 작용기전 및 산업적 이용을 중심으로 설명하고자 한다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제25권8호
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• pp.1339-1348
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• 2015

Until now, considerable effort has been made to engineer novel nitrogen-fixing organisms through the transfer of nif genes from various diazotrophs to non-nitrogen fixers; however, regulatory coupling of the heterologous nif genes with the regulatory system of the new host is still not well understood. In this work, a 49 kb nitrogen fixation island from P. stutzeri A1501 was transferred into E. coli using a novel and efficient transformation strategy, and a series of recombinant nitrogen-fixing E. coli strains were obtained. We found that the nitrogenase activity of the recombinant E. coli strain EN-01, similar to the parent strain P. stutzeri A1501, was dependent on external ammonia concentration, oxygen tension, and temperature. We further found that there existed a regulatory coupling between the E. coli general nitrogen regulatory system and the heterologous P. stutzeri nif island in the recombinant E. coli strain. We also provided evidence that the E. coli general nitrogen regulator GlnG protein was involved in the activation of the nif-specific regulator NifA via a direct interaction with the NifA promoter. To the best of our knowledge, this work plays a groundbreaking role in increasing understanding of the regulatory coupling of the heterologous nitrogen fixation system with the regulatory system of the recipient host. Furthermore, it will shed light on the structure and functional integrity of the nif island and will be useful for the construction of novel and more robust nitrogen-fixing organisms through biosynthetic engineering.

• 생명과학회지
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• 제31권11호
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• pp.1046-1055
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• 2021

바닐린은 천연 바닐라의 주요 향미 화합물이며 식품, 음료, 향수, 제약 산업 및 기타 응용 분야에서 광범위하게 사용된다. 바닐린은 화학합성법, 바닐라 꼬투리를 이용한 식물추출법, 천연 전구체를 이용한 생물전환법, 그리고 포도당을 사용한 직접 발효법에 의해 생산될 수 있다. 현재 상업적으로 이용 가능한 대부분의 바닐린은 큐어링 공정을 거쳐 얻어진 바닐라 꼬투리에서 추출하는 방법과 구아이아콜과 글리옥실산을 원료로 사용하여 화학적 합성법에 의해 생산된다. 환경 문제, 건강 준수, 천연 원료에 대한 선호, 천연 바닐라의 제한된 공급 및 치솟는 가격으로 인해 생명 공학 기반 바닐린 생산은 유망한 대안으로 간주된다. 페룰산, 유제놀, 이소유제놀, 리그닌을 포함한 여러 천연 전구체를 대사하고 바닐린을 축적할 수 있는 많은 미생물이 선별되고 평가되면서, 상업적으로 실행 가능한 생산 기술 개발을 위해 많은 노력을 기울였다. 본 총설은 이러한 천연 전구체를 사용하여 천연 바닐린의 생물공학적 생산에 대한 최근의 발전을 간략하게 설명한다. 또한, 포도당에서 바닐린의 새로운 생합성 경로를 기반으로 재생 가능한 탄소원에서 천연 바닐린을 생산하기 위한 최신의 개발 전략과 생산 농도를 높이는 데 발생하는 문제를 극복하기 위한 적절한 해결방안을 소개한다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제48권1호
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• pp.1-15
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• 2005

농작물이 병해충 및 잡초 등에 의하여 피해를 받게 되면 농업생산성은 상당히 저하된다. 따라서 농업생산성을 높이기 위하여 합성농약을 과용해 왔고, 이로 인하여 토양의 질과 농업환경이 파괴되는 결과를 초래하고 있어서 지속적인 농업이 점차 어려워지고 있다. 오늘날의 농업은 농업환경의 파괴를 최소화하고 농산물의 안전성을 확보함과 동시에 생산성을 증대해야하는 복합적인 문제에 직면해 있다. 한편, 식물은 일반적으로 생존하기 위하며 외부의 침입으로부터 자신을 보호하거나 자신의 영역을 확보하기 위하며 다양한 종류의 2차대사물질을 생산하고 방출한다. 병원균이 침입했을 때 식물이 생산하는 항생물질인 phytoalexin으로는 화본과 식물의 경우 flavonoid계와 diterpenoid계의 물질을 생성하고, 쌍자엽 식물은 감염된 병원균의 종류에 상관없이 Leguminosae과는 flavonoids계, Cruciferae과는 indole 유도체, Solanaceae과는 sesquiterpenoid계, Umbelliferae과는 coumarin계 물질들을 생성하여 병원균에 저항성을 가진다. 곤충의 생리작용을 저해하거나 섭생을 싫어하게 하는 기능의 물질로는 terpene계의 pyrethrin, azadirachtin, limonin, cedrelanoid, toosendanin, fraxinellone/dictamnine 등이 있으며, alkaloid계로서는 terpenoid와 alkaloid가 결합된 sesquiterpene pyridine 및 norditerpenoids alkaloids와 azepine계, amide계, loline계, stemofoline계, pyrrolizidine계 alkaloids 등이 있다. 식물은 또한 자신의 영역을 확보하기 위하여 다른 식물의 생장을 저해하는 물질을 생성하는데 여기에는 terpene계의 essential oil 및 sesquiterpene lactone과 이외에 benzoxazinoids, glucosinolate, quassinoid, cyanogenic glycoside, saponin, sorgolennone, juglone 등 다수의 2차 대사물질들이 있다. 이와 같은 기능의 2차 대사물질을 병해충 및 잡초 방제에 직, 간접으로 이용하는 것은 친환경농업의 한 가지 방법일 수 있다. 그러나 천연물질들은 자연계에서 쉽게 분해되어 효율이 떨어지는 경우가 많고 식물을 통하여 생산하는데도 한계가 있다. 따라서 보다 안전성과 효율성이 뛰어난 2차 대사물질을 찾아내는 연구와 아울러 방제기능이 있는 물질의 생합성경로를 구명하고 대사공학적으로 이용하므로 병해충에 저항성이 있고 잡초 방제효과를 갖는 형질전환 식물을 육성하는 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것이다.