• 한국수정란이식학회지
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• 제7권2호
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• pp.81-88
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• 1992

Cryopreservation of mouse embryos biopsied at 4-cell stage was investigated by ultrarapid freezing. Four-cell embryos were obtained from ICR mice on 55h after hCG injection. Zona pellucida of the embryos were partially dissected with a cutting pipet, and then single blastomeres were biopsied from the embryos followed by incubation in $Ca^2$+ and $Mg^2$+-free M16 medium for 30min. Biopsied embryos cultured for lh or 15h were frozen by ultrarapid freezing method using 3M DMSO or 5M glycerol as a cryoprotectant, respectively. The developmental rate of biopsied embryos after ultrarapid freezing and thawing to blastocysts was 81 % in the group of biopsied embryos cultured for lb and 98% in the group of biopsied embryos cultured for 15h, respectively. When biopsied embryos after ultrarapid freezing and thawing were transferred to the uteri of pseudopregnant recipients, normal live young were born. These results suggest that this freezing method can efficiently cryopreserve biopsied mouse embryos.

• 한국수정란이식학회지
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• 제20권2호
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• pp.169-176
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• 2005

수정란의 성 판별은 유전적으로 우수한 유전형질을 보유하고 있는 소의 수정란을 성 판별하므로서 희망하는 성의 송아지를 생산할 수 있으며, 부가가치가 높은 수정란을 확보할 수 있는 기술이다. 수정란의 손상을 최소화하면서 할구를 biopsy하는 기술을 개발하고, 간단하고 빠른 시간에 성 판별이 가능한 Loop-mediated isothermal amplification방법으로 수정란을 성 판별을 실시한 결과는 다음과 같다. 1. 한우 체내 수정란의 성비는 암컷이 $56.5\%$, 수컷이 $43.5\%$였고, 체외 수정란은 암컷이 $49.2\%$, 수컷이 $33.9\%$였다. 그리고, 젖소 체외 수정란의 성비는 암컷이 $29.2\%$, 수컷이 $70.8\%$를 나타내어 한우 체내 및 체외 수정란보다 젖소 체외수정란의 수컷비율이 유의적으로 높게 나타내었다(p<0.05). 또한, 한우 체외 수정란에서 성 판별이 불가능한 것이 $16.9\%$를 나타내어 한우 체내 수정란 및 젖소 체외 수정란과는 유의적인 차이를 나타내었다.(P<0.05). 2. Biopsy한 체내 수정란의 체외 발달율은 $100\%$였으나 체외 수정란에서는 정상적으로 발달하지 못하고 퇴화된 수정란이 $13.2\%$로 체내 수정란보다 유의적으로 높은 결과를 나타내었다.(P<0.05). 3. Punching 방법으로 수정란의 biopsy 후 정상적으로 발달하지 못하고 퇴화된 수정란은 체내 및 체외 수정란에서는 없었으나 biopsy 방법으로 biopsy한 수정란은 체내 및 체외 수정란에서 각각 $16.7\%$ 및 $22.6\%$를 나타내어 Punching 방법보다 유의적으로 높은 결과를 나타내었다(P<0.05). 이상의 결과로 보아 한우 체내 수정란은 LAMP방법을 이용하여 간단하고 신속하게 성 판별이 가능하며, 수정란의 biopsy는 punching 방법이 수정란에 손상을 적게 주는 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제15권3호
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• pp.219-230
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• 2000

This study was carried out to determine the factors on achieving good viability of embryos biopsied fur sexing, to investigate pregnancy rate following embryo transfer(ET) with sexed embryos, and to confirm the accuracy for the calves bort following ET with sexed embryos by polymerase chain reaction(PCR). To investigate viability of Hanwoo embryos after biopsy for sexing, fresh and frozen/thawed embryos were biopsied according to different developmental day of blastocysts, different stage of blastocysts, and different biopsy grade and the embryos themselves were incubated for 2 hours in TCM199 after microsection to be evaluated morphologically for recovery as blastocyst. The results obtained were as follows : 1. The rate of oocytes cleaved in vitro and the rate of blastocyst of the cleaved oocytes were 52.5% and 21.6%, respectively. The rate of blastocyst on day 8 was 11.2%, denoting the highest rate during whole culture period posterior to in vitro fertilization(IVF) 2. After biopsy for sexing, the viability rate of blastocyst on day 7, 8 and 9 was 75.0%, 88.4%, and 100.0%, respectively and the viability of early, mid, and expanded blastocyst after biopsy was 75.0%, 88.9%, and 91.1%, respectively The viability rate of fresh and frozen/thawed embryos was 89.9%, 71.4%, respectively. And the viability of expanded, hatching, and hatched blastocyst of frozen/thawed embryos was : 75.0%, 75.0%, and 50.0%, respectively. The viability of embryos according to biopsy grade of 10∼20%, 21∼30%, and 31∼40% was 85.7%, 91.5%, and 71.4%, respectively. 3. Pregnancy rate after transfer with biopsied embryo between flesh and frozen/thawed embryos was 22.6% and 20.0%, respectively. 4. In comparison between sex by PCR method and sex of calves born after embryo transfer, the accuracy of sex deterimination was 92.3% (12/13).

• 한국수정란이식학회지
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• 제18권2호
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• pp.97-108
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• 2003

체외수정된 한우 수정란을 PCR 기법에 의한 성감별을 위해 생검하여 회복시까지 1∼2시간 동안 배양하였다. 이 성감별된 한우 수정란을 2000년 2월부터 2001년 2월까지 한우 49두와 젖소 16두에 이식하였다. 수정란이 이식된 65두의 수란우중 14두(한두 12두, 젖소 2두)가 성감별 결과와 동일한 성의 산자를 생산하였고, 전체 수태율은 21.5%를 나타내었다. 1. 총 65두의 수란우중 웅성 수정란은 35두에 자성 수정란은 30두에 이식되었고 이중 분만된 산자 14두중 웅성은 6두, 자성은 8두였으며 PCR에 의한 성감별 정확도는 100.0%를 나타내었다. 2. 성감별된 한우 수정란은 한우와 젖소에 이식한 후 수태율은 각각 24.5, 12.5%를 나타내었다. 3. 성감별된 한우의 신선수정란과 동결-융해된 수정란의 이식후 수태율은 각각 23.5, 14.3%를 나타내었다. 4. 성감별된 한우 수정란의 이식 시기에 따른 수태율은 봄, 여름, 가을, 겨울에 각각 11.8, 29.4, 23.4, 20.0%를 나타내었다 5. 성감별된 한우 수정란의 상태에 따른 이식후 수태율은 excellent, good, fair군에서 각각 41.7, 30.0, 0.0%를 나타내었다. 6. 성감별된 한우 수정란의 이식시 수란우의 자궁각 두께에 따른 이식후 수태율은 0, +, ++, +++군에서 각각 71.4, 18.9, 11.8, 0.0%를 나타내었다. 7. 성감별된 한우 수정란이 주입된 수란우 자궁각 부위에 따른 이식후 수태율은 자궁각 선단부, 중심부, 미부에서 각각 30.0, 20.0, 10.0%를 나타내었다. 8. 성감별된 한우 수정란의 이식시 수란우의 황체의 상태에 따른 이식후 수태율은 excellent, good, poor군에서 각각 41.2, 14.3, 15.4%를 나타내었다. 9. 성감별된 한우 수정란을 straw에 장착후 이식시까지 10, 15, 20, 25, 30분 경과에 따른 이식후 수태율은 18.2, 30.0, 30.0, 0.0, 25.0%를 나타내었다. 10. 성감별된 한우 수정란의 이식시 수란우의 산차에 따른 이식후 수태율은 1산차, 2산차, 3산차, 4산차에서 각각 26.5, 19.1, 14.3, 0.0%를 나타내었다. 이상의 결과에서 성감별된 수정란의 이식시 양호한 수태율을 얻기 위해서는, 신선수정란이 동결수정란 보다 유리하다는 점과 생검후 수정란의 회복상태, 수란우의 자궁각 두께, 수정란의 수란우 자궁각 주입부위, 수란우의 황체 상태, 이식시까지 소요시간, 수란우의 산차를 고려해야 한다는 것을 알 수 있었다.

• 한국발생생물학회:학술대회논문집
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• 한국발생생물학회 2003년도 제3회 국제심포지움 및 학술대회
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• pp.92-92
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• 2003

Accurate analysis of nuclear status is needed when biopsied-blastomeres are used for embryo sexing. In this study, the nuclear status of blastomeres derived from 8- to 16-cell stage IVF bovine embryos was analyzed to evaluate the representative of single blastomere for embryo sexing. When 55 embryos were analyzed by PCR following biopsy, the coincident rate of sex determination between biopsied-single blastomere and matched blastocyst by PCR was 80 %. Karyotyping of biastomeres in 8- 16-cell stage bovine embryos was conducted to assess chromosome status of IVF embryos. To establish karyotyping of blastomeres, concentrations of vinblastine sulfate and duration of exposure time for metaphase plate induction with 8- to 16-cell stage bovine embryos were tested. The most effective condition for induction of metaphase plate (>45%) was 1.0 ug/ml vinblastine sulfate treatment for 15 h. In 22 embryos under the condition, only 8 embryos out of ten that had a normal diploid chromosome complement showed a sex-chromosomal composition of XX or XY (36.4%) and 2 diploid embryos showed mosaicism of the opposite sex of XX and XY in blastomeres of embryo (9.1%). One haploid embryo contained only one X-chromosome (4.5%). Four out of the other 11 embryos having a mixoploid chromosomal complement contained haploid blastomere with wrong sex chromosome (18.2%). These results suggested that morphologically normal bovine embryos derived from IVF had considerable proportion of mixoploid and sex-chromosomal mosaicism which could be the cause of discrepancies of the sex between biopsied-single blastomere and matched blastocyst by PCR analysis.

• 대한생식의학회:학술대회논문집
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• 대한생식의학회 2007년도 제53차 추계학술대회 초록집
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• pp.100-100
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• 2007

• Current Research on Agriculture and Life Sciences
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• 제9권
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• pp.29-36
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• 1991

본(本) 연구는 생쥐의 4세포기배(細胞期胚)에서 하나의 할구(割球)를 뽑아내는 새로운 할구분유기술(割球分維技術)인 biopsy에 대한 효율성과 분리(分離)된 수정란(受精卵)과 분리(分離)한 할구(割球)의 생존성 및 새끼생산율을 검토한 결과(結果)이다. 그 결과(結果)를 요약(要約)하면 다음과 같다. 1. 4세포기배(細胞期胚)에서 분리(分離)한 단일해구(單一害球)와 4세포기배(細胞期胚)를 M2 배양액에 배양한 결과(結果), 단일해구(單一害球)는 82.6%가 영양배엽을 형성한 할구(割球)로 발생(發生)하였고 4세포기배(細胞期胚)로 89.5%가 배반포기배(胚盤胞期胚)로 발생(發生)하였다. 2. 4세포기배(細胞期胚)를 biopsy하여 하나의 할구(割球)가 분리(分離)된 수정란(受精卵)과 대조구인 4세포기배(細胞期胚)를 M2배양액에서 배양한 결과 각각 83.3%와 90.4%가 배반포기배(胚盤胞期胚)로 발생(發生)하였다. 3. Biopsy하여 4세포기배(細胞期胚)에서 분리(分離)한 단일해구(單一害球)와 대조구인 4세포기배(細胞期胚)에서 4개의 할구(割球)로 분리한 단일해구(單一害球)를 M2 배양액에서 배양한 결과 각각 80.8% 와 83.3%가 영양배엽을 형성한 할구(割球)로 발생(發生)하였다. 5. 4세포기배(細胞期胚)에서 하나의 할구(割球)를 뽑아낸 수정란(受精卵)과 대조구인 4세포기배(細胞期胚)를 수란생쥐에 이식한 결과 각각 36.0%와 48.6%의 새끼쥐 생산율(率)을 얻었다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제26권1호
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• pp.9-20
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• 1999

The genetic defects in human gametes and embryos can cause adverse effects on overall reproductive events. Biopsy of embryos for preimplantation genetic diagnosis (PGD) offers a new possibility of having children free of the genetic disease. In addition, advanced embryo culture method may enhance the effectiveness of embryo biopsy for the practical application of PGD. This experimental study was undertaken to evaluate the effects of coculture on the development in vitro of biopsied mouse embryos as a preclinical model for PGD of human embryos. Embryos were obtained after in vitro fertilization (IVF) from F1 hybrid mice (C57BLfemale/CBAmale). Using micromanipulation, 1, 2, 3 or 4 blastomeres of 8-cell stage embryos were aspirated through a hole made in the zona pellucida by zona drilling (ZD) with acidic Tyrode's solution (ATS). After biopsy of blastomeres, embryos were cultured in vitro for 110 hours in Ham's F-10 supplemented with 0.4% BSA or cocultured on the monolayer of Vero cells in the same medium. The frequence of blastocyst formation were recorded, and the embryos beyond blastocyst stage were stained with 10% Giemsa to count the total number of nuclei in each embryo. There was no significant difference in the blastocyst formation between the zona intact control group and the zona drilling (ZD) only, or biopsied groups. The hatching rate of all the treatment groups except 4/8 group was significantly higher than that of control group. In all the treatment groups, there was a significant reduction in the mean cell number of embryos beyond blastocyst stage ($50.2{\pm}14.0$ in control group vs. $41.2{\pm}7.9$ in ZD, $39.3{\pm}8.8$ in 7/8, $29.7{\pm}6.4$ in 6/8, $25.1{\pm}5.7$ in 5/8, and $22.1{\pm}4.3$ in 4/8 groups, p<0.05). When the same treatments were followed by coculture with Vero cells, a similar pattern was seen in the blastocyst formation and the hatching rate. However, in all the treatment groups, there was a significant increase in the mean cell number of embryos beyond blastocyst stage with coculture, compared with the parallel groups without coculture. In the cleavage rate of biopsied blastomeres cultured for 110 hours after IVF, there was no significant difference between coculture and non-coculture groups (87.2% vs. 78.7%). However, the mean cell number of embryos developed from the biopsied blastomeres was significantly higher in coculture group ($11.5{\pm}4.7\;vs.\;5.9{\pm}1.9$, p<0.05). In conclusion, biopsy of mouse embryos after ZD with ATS is a safe and highly efficient method for PGD, and coculture with Vero cells showed a positive effect on the development in vitro of biopsied mouse embryos and blastomeres as a preclinical model for PGD of human embryos.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권2호
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• pp.207-214
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• 1996

본 연구는 미세조작된 수정란의 초급속 재동결 후 발생능을 조사하기 위해서 수행하였다. 먼저 4세포기 생쥐 수정란으로부터 할구세포 한 개를 떼어내고 이들 수정란을 동결액에 넣어 상온에서 2.5분간 평형시킨 다음, 0.25ml straws에 넣어 곧바로 액체질소에 침지시켰다. 4세포기 수정란의 동결액으로는 4.0M(ethylene glycol 및 0.25M sucrose가 함유된 dPBS를 사용하였따. 상실배기 수정란의 동결을 위해서는 항동해제로 4.0M ethylene glycol 대신에 5.0M glycerol을 사용하였다. 융해후 biopsied 4세포기 수정란을 M16 배양액에서 상실배기까지 발달시킨 다음 상실배기용 동결액을 이용하여 초급속 재동결을 실시하였다. 재동결융해 후 발달한 biopsied 배반포기 수정란을 대리모에 이식하여 이들 수정란의 생존성을 검토하였다. 제1차 동결후 biopsied 수정란의 체외발달률은 78%로서 정상적인 수정란의 발달율(91%) 보다 낮은 성적으로 보여주었으나 (P<0.01), 이들 수정란의 이식 후 임신률은 각각 25 및 30%로서 두 실험군간에 차이가 인정되지 않았다. 그리고 biopside 상실배기 수정란의 초급속 재동결후 체외 발달률 및 임신률은 각각 89와 27%로서 biopsied 되지 않은 수정란의 성적 (각각 95 및 28%)과 유사하였다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때, 본 연구에서 사용된 초급된 재동결 과정이 미세조작된 생쥐수정란의 생존성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

• Journal of Animal Science and Technology
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• 제49권2호
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• pp.287-294
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• 2007

성판별을 위한 biopsy 후 수정란의 발달율 및 동결－융해 후의 생존율 조사는 다음과 같다. 한우 체내 및 체외 수정란의 성판별을 위해서 영양막 세포의 일부를 채취하기 위해서 수정란을 biopsy 하였다. biopsy된 수정란의 생존율 조사의 결과는 체내 수정란이 100% 그리고 체외수정란이 90.0%의 결과를 나타내어 체내 수정란이 체외 수정란 보다 biopsy 후의 생존율이 높게 나타났음을 알 수 있었다. 수정란의 성판별 비율은 체내 수정란에서는 암컷과 수컷의 비율이 46.3%와 53.7%로 각각 나타나 수컷의 비율이 암컷 보다 다소 높은 경향을 보였으며, 체외 수정란에 있어서는 암컷과 수컷의 비율은 40.0% 와 60.0%로 수컷의 비율이 높게 나타났으나 유의적인 차이는 보이지 않았다. 성판별된 수정란의 동결－융해 후 생존성은 완만동결 방법에 의한 수정란의 생존율은 체내 수정란에서 58.8 %, 체외 수정란에서는 41.7% 그리고 초자화동결 방법에서는 체내 수정란의 생존율이 77.8%, 체외 수정란은 57.1%로의 결과를 보여 체내 수정란을 이용한 초자화동결 방법에서 상대적으로 더 높은 생존율을 보였다.