• Journal of Microbiology
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• 제43권4호
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• pp.361-365
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• 2005

In this study, we chronicle the establishment of a novel transformation system for the unicellular marine green alga, Dunaliella salina. We introduced the CaMV35S promoter-GUS construct into D. salina with a PDS1000/He micro-particle bombardment system. Forty eight h after transformation, via histochemical staining, we observed the transient expression of GUS in D. salina cells which had been bombarded under rupture-disc pressures of 450 psi and 900 psi. We observed no GUS activity in either the negative or the blank controls. Our findings indicated that the micro-particle bombardment method constituted a feasible approach to the genetic transformation of D. salina. We also conducted tests of the cells' sensitivity to seven antibiotics and one herbicide, and our results suggested that 20 ${\mu}g$/ ml of Basta could inhibit cell growth completely. The bar gene, which encodes for phosphinothricin acetyltransferase and confers herbicide tolerance, was introduced into the cells via the above established method. The results of PCR and PCR-Southern blot analyses indicated that the gene was successfully integrated into the genome of the transformants.

• Plant Resources
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• 제8권3호
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• pp.202-208
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• 2005

Osmotic stress is one of major limiting factors in crop production. In particular, seasonal drought often causes the secondary disease in the field, resulting in severe reduction in both quality and productivity. Recent efforts have revealed that many genes encoding protein kinases play important roles in osmotic stress signal transduction pathways. Previously, the AtSIK (Arabidopsis thaliana Stress Inducible Kinase) mutants have shown to enhance tolerance to abiotic stresses, accompanying with higher expression of abiotic stress-related genes than did the wild-type plants. In this study, we have transformed potato (cv. Taedong Valley) with the AtSIK expression cassette. Both PCR and RT-PCR using AtSIK-specific primers showed stable integration and expression of the AtSIK gene in individual transgenic lines, respectively. Foliar application of herbicide ($Basta^{(R)}$) at commercial application rate (0.3% (v/v)) revealed another evidence of stable gene introduction of T-DNA which includes the bar gene for herbicide resistance. Overexpression of the AtSIK gene under dual CaMV35S promoter increased sensitivity to salt stress (300 mM NaCl), which was demonstrated by the reduction rate of chlorophyll contents in leaves of transgenic potato lines. These results suggest that possible increase of osmotic tolerance in potato plants may be achieved by antisense expression of AtSIK gene.

• 식물조직배양학회지
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• 제26권4호
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• pp.281-287
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• 1999

본 연구에서는 제초제 저항성 더덕을 개발하고자 하여 제초제 저항성 bar유전자의 형질전환을 수행하였고, 더덕 종자 발아 생리, 체세포배 유도 및 선별배지 농도 등에 대해 조사하였다. 기내종자발아는 GA$_3$를 첨가한 MS배지에 치상하여 15$^{\circ}C$에서 배양하였을 때 광, 암 두 조건 모두에서 90%의 발아율을 나타내었다. 식물체 재분화는 체세포 배발생 경로를 통하여 이루어 졌다. 배발생 캘러스는 자엽, 줄기,잎을 2,4-D와 Zeatin을 혼용처리하여 유도할 수 있었다. Basta와 PPT는 10mg/L 이상의 농도에서 식물체가 갈변고사 하였다. Explant는 l00mg/L 이상의 kanamycin에서 캘러스를 형성하지 못하였다. Explant를 제초제 저항성 bar유전자의 식물 형질전환 벡터를 포함하는 Agrobacterium tumefaciens LBA4404과 2일간 공존 배양한 후, 100mg/L kanamycin, 500mg/L carbenicillin과 1.0mg/L 2,4-D이 포함된 배지에서 형질전환체를 선발하였고, 계대배양으로 배발생 캘러스를 유도하고 체세포배를 얻었다. 체세포배를 200 mg/L kanamycin,500mg/L carbenicillin이 포함된 N6배지에 치상하여 발아시켰다. PCR 수행결과 NPTII와 bar유전자가 증폭되어 나타남으로서 도입된 유전자가 잠정적인 형질전환체 내에 존재함을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 얻어진 bur유전자 형질전환 식물체는 RNA및 단백질 수준에서의 발현 여부 검정을 거친 후, 제초제 저항성 더덕 생산 및 제초제 저항성 유전자의 후대 유전 양상 분석을 위한 기초 자료로 이용될 수 있을 것이다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제32권2호
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• pp.85-90
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• 2005

밀양 204호는 작물과학원 영남농업연구소 생명공학연구팀이 직파적응 제초제저항성 벼 품종을 육성할 목적으로 '98년 bar 유전자를 동진벼에 아그로박테리움법으로 형질 전환하여 제초제저항성 벼를 양성하였다. '98/'99년 동계에 단간 내도복 양질인 주남벼를 인공교배하여 약배양 등 육종프로그램에 적용하여 우량계통을 선발하고 밀양 204호로 계통명을 부여하였다. GM 벼와 Non-GM 벼의 농업적 특성을 UPOV 및 국립종자관리소의 품종등록 기준에 따른 농업적특성 중 차이가 있었던 것은 엽색도, 지엽의 형태, 간장, 수당립수 등 이었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제50권
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• pp.63-69
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• 2023

본 연구는 유채(Brassica napus L.)의 배축을 이용하여 수량 증대 유전자인 ORE7 그리고 선발유전자로 제초제저항성을 나타내는 bar 유전자를 Agrobacterium 기법을 이용하여 형질전환 하였다. 효율적인 유채형질전환 기법을 확립하기 위해 한국 유채 '영산' 품종의 배축 절편체를 이용하여 Agrobacterium 접종 시, 20분간의 접종시간 그리고 3일간의 공동배양기간을 적용할 때 100개의 접종된 배축 절편체들로부터 약 32-36개 개체가 PPT (Phosphinothrixin) 20 mg/l 첨가된 선발배지에서 생존하여 높은 형질전환 효율을 보여주었다. 또한 본 연구에서 도입된 선발 및 생산성 증대 유전자 도입 여부를 확인하기 위해 PCR을 수행하여 도입여부를 확인하였다. 또한 생산성 증대 유전자 ORE 7 유전자와 같이 도입된 bar 유전자의 발현여부를 확인하기 위해 0.5% Basta 용액에 처리한 결과, 제초제저항성 형질이 발현됨을 확인하였다. 본 연구결과를 통해 향후 국내 유채품종을 대상으로 Agrobacterium을 이용하여 제초제 저항성, 건조저항성. 생산성 증대 형질 그리고 오일함량 증대 등의 유용형질 개량에 이용되리라 판단된다.

• 한국약용작물학회지
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• 제15권4호
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• pp.285-290
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• 2007

본 연구는 Agrobacterium을 매개로 도라지에 PAT 유전자를 도입하여 ‘바스타’에 저항성을 가지는 형질전환 도라지를 개발하는 기술을 확립하기 위하여 수행되었다. 종자를 무균적으로 발아시킨 후 10일 된 미성숙 자엽과 성숙엽에 Agrobac-terium을 접종하고 1/10 MS 배지에서 48시간 동안 공동 배양하였다. 공동배양 후 부정아 유도를 위해 MS 선발배지 (0.2 $mg/{\ell}$ NAA, 1.0 $mg/{\ell}$ BA, 3% 설탕, pH 5.8; 3 $g/{\ell}$ gelrite, 100 $mg/{\ell}$ kanamycin, 500 $mg/{\ell}$ carbenicillin)에 치상하여 배양한 결과 미성숙 자엽의 절편에서 형질전환체로 추정되는 부정아가 형성되었고, 선발배지에 2회 계대배양하여 형질전환 추정체를 선발하였다. 이러한 형질전환 추정체는 GUS, PCR 분석 및 RT-PCR 분석에 의하여 형질전환체로 확인되었다. 또한 10 $mg/{\ell}$ 의 phosphinothricin이 함유된 배지에서 배양하여 형질전환 여부를 확인하였고, 순화재배 후 0.3% ‘바스타’를 살포한 결과 형질전환 도라지는 제초제에 저항성을 보였다. ‘바스타’에 저항성을 보인 도라지 식물체는 정상적인 생육을 계속하여 개화하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제31권1호
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• pp.7-11
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• 2004

형질전환 식물체를 직접 이용하기에는 후대에 유전적인 고정 및 포장검정이라는 문제가 대두되는데, 이를 해결하기 위하여 본 연구는 바스타저항성 유전자가 도입된 벼와 직파적 응성 계통을 교잡한 후 약배양에 의한 형질전환체 고정 등 기존 육종체계와 연계하여 제초제 저항성 직파적응 계통을 조기에 육성할 수 있는 체계를 확립하고자 수행하였다. 제초제 저항성 직파적응 계통을 조기에 육성하고자 1999년 동계에 교배된 동진벼 Ds15(Ba $r^{R}$)/주남벼 등 5조합으로부터 2000년 $F_1$을 양성하고, 이들을 PCR분석으로 제초제 저항성 유전자 bar도입을 확인한 후 약배양을 실시하여 얻어진 1,508개의 재분화 식물체 중 제초제 저항성 유전자가 도입된 169개체 ( $A_2$)에서 채종하였다. 이들을 2001년 포장에 공시하여 42계통을 선발하고,2002년에 동진벼 Ds15 (Ba $r^{R}$)/주남벼 조합에서 수량 등 주요 농업형질이 우수한 7계통을 생산력 검정시험에 공시한 결과 제초제 저항성이면서 직파적응성 등 기타 농업형질이 우수한 YR23235Acp79를 선발하여 밀양 204호로 계통명을 부여하였다. 결과적으로 형질전환체를 이용하여 교배부터 계통선발까지 3년 만에 목적하는 계통을 조기에 육성할 수 있는 생력육종체계가 확립되었다.

• 한국자원식물학회:학술대회논문집
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• 한국자원식물학회 2002년도 제9차 국제심포지움 및 추계정기학술발표회
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• pp.30-30
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• 2002

꿩의비름 (Sedum erythrostichum)은 매우 우수한 지피식물이며 건조에 강한 대표적 식물로 바위정원 (rock garden)을 가꾸는데 있어서 중요한 수종으로 이용되며, 유럽등지에서는 지붕에 식재하기도 하며 최근에는 빌딩옥상녹화의 대표적 수종으로 식재되고 있다. 또한 한방에서는 경천이라 불리우기도 하는데 피부상처 치유 및 미백효과가 탁월하다고 알려져 있다. 본 연구에서는 Agrobacterium을 매개로한 꿩의비름의 형질전환 시스템을 개발하고 아울러 phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) 유전자를 도입하여 제초제 저항 식물을 개발하고자 수행되었다. 꿩의비름 잎을 Agrobacterium에 담근후 0.5 mg/l NAA와 2 mg/1 BA가 첨가된 MS 배지에 3일간 공동배앙 하였다. 그 후 300 mg/1 cefotaxime이 첨가된 같은 배지에 옮겨 계대하면서 Agrobacterium을 제거하였다. 약 3주후에 잎 절편으로 부터 직접적으로 부정아가 형성되기 시작 하였는데 이 시기부터 잎 절편을 25 mg/1 kanamycin이 첨가된 선발배지에 옮겨 주었다. 이 결과 배양된 잎 절편 절편 중 3.75%에서 kanamycin에 저항하는 부정아를 얻을 수 있었다. 형질전환체는 X-gluc 반응, PCR, Southern, Nothern analysis를 통하여 확인하였다. 약 94%의 형질전환 식물체는 성공적으로 토양에 옮길 수 있었으며 약 3개월후에 꽃을 피웠다. 형질전환체는 제초제인 Basta ($^{(R)}$ phosphinothricine at 200 mg/1)를 살포하여 주었을 경우 생존함을 확인 하였다.

• Plant Resources
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• 제7권1호
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• pp.39-46
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• 2004

To demonstrate the importance of transformation efficiency in independent event, molecular and cytogenetic analysis were conducted with genomic DNA and chromosome of transgenic plants produced by Agrobacterium tumefeciens LBA4404 (pSBM-PPGN: gusA and bar). Selection ratios of putative transgenic calli were similar in independent experiments, however, transformation efficiencies were critically influenced by the type of regeneration media. MSRK5SS-Pr regeneration mediun, which contains 5 mgL$^{-1}$ kinetin, 2% (w/v) sucrose in combination with 3% (w/v) sorbitol, and 500 mgL$^{-1}$ proline, was efficient to produce transgenic plant of rice from putative transgenic callus in the presence of L-phosphinotricin (PPT). With MSRK5SS-Pr medium, transformation efficincies of Nagdongbyeo were significantly enhanced from 3.7% to 6.3% in independent callus lines arid from 7.3% to 19.7% in plants produced, respectively. Stable integration and expression of bar gene were confirmed by basta herbicide assay, PCR amplification and Southern blotting of bar gene, and fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis using pSBM-PPGN as a probe. In Southern blot analysis, diverse band patterns were observed in total 44 transgenic plants regenerated from 20 independent PPT resistant calli showing from one to five copies of T-DNA segments, however, the transformants obtained from one callus line showed the same copy numbers with the same fractionized band patterns.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제38권4호
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• pp.293-300
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• 2011

실험은 심비디움 원괴체 (PLB: protocorm-like bodies)를 재료로 유전자총을 이용한 효율적인 형질전환 조건을 확립하고자 수행되었다. 이 PLB 조직에 제초제저항성 유전자인 bar 유전자와 reporter 유전자인 gus를 포함하고 있는 pCAMBIA3301 벡터를 이용하여 유전자총으로 형질전환 하였다. 형질전환 벡터에 포함되어 있는 제초제저항성유전자 (bar)를 이용하여 선발하게 되므로 선발배지에 첨가될 제초제로서 PPT (Phosphinotricin)의 적정 농도를 찾고자 실험한 결과, 5 mg/l에서 최적의 대부분의 PLB의 생육이 억제되고 신초형성이 이루어지지 않았다. 이를 기반으로 유전자총 실험에 맞는 최적 조건을 찾는 실험을 수행하여 1.0 ${\mu}m$ gold입자크기, 헬륨가스 압력은 1,100과 1,350 psi사이에서는 차이가 없다는 전제 하에 물리적 피해가 덜 가는 1,100 psi를 조건으로 선택하였고, 유전자총과 목표물과의 거리는 6 cm 그리고 DNA 농도는 1회 유전자총 발사횟수당 1.0 ${\mu}g$ 조건을 최적조건으로 하였다. 이 조건을 기반으로 100개의 PLB를 형질전환 하면 평균적으로 6 ~ 8개의 PLB가 제초제 저항성을 나타내는 개체로 성장하고 최종적으로 2개체 정도가 온실에서 순화과정을 거쳐 완전한 형질전환 식물체로 생산된다. 이외에도 유전자총 실험 전에 0.2 M sorbitol과 0.2 M mannitol을 혼합처리하여 4시간 동안 배양시키면 2배 이상 효율을 높일 수 있게 되어, 결론적으로 100개의 PLB를 형질전환 수행하면 최종적으로 3.2 ~ 4.0개 정도의 형질전환 심비디움 식물체가 나오는 효율이라고 할 수 있다. 본 실험을 통해 생산된 형질전환 심비디움 개체들은 PCR 분석을 통해 유전자 도입을 확인하였고, 형질전환 개체 중 임의로 선발된 5계통들의 잎을 Basta 0.5% 용액에 침지한 결과, 3 계통은 제초제에 저항성을 가지는 것으로 확인되었고, 그중 1계통은 아주 강한 저항성을 보여주었다. 본 실험 결과들을 바탕으로 환경저항성 등의 유용유전자가 도입된 형질전환 심비디움 식물체 개발에 기여하리라 사료된다.