국내산 참당귀의 생리활성 물질을 이용한 건강 기능성 식품 또는 화장품 소재 개발을 위한 기초연구의 일환으로 참당귀 뿌리를 3종류의 곰팡이 균주, A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus 균주로 발효시켜 polyphenolic compounds, flavonoids, minerals, decursin 및 decursinol angelate 함량 분석과 항산화, 환원력 및 tyrosinase 활성을 측정 하였다. 참당귀 뿌리의 decursin과 decursinol angelate의 총 면적에 대한 함량 비율은 각각 44.0 및 27.3% 였으며, 한편 A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus에 의한 발효 당귀의 decursin 함량 비율은 각각 52.0, 54.4 및 53.7% 였다. 참당귀 뿌리의 polyphenolic compounds 함량은 2.78% 였으나 발효 당귀에서 모두 약간씩 감소하였고, flavonoid 함량은 1.03% 함유되었으나 M. purpureus 발효 당귀에서 1.18%로 약간 증가하였다. 참당귀 뿌리의 미네랄 조성은 K, Mg, Fe, Ca, Na, Mn, Zn 순이였으며, 발효당귀에서 Na은 감소하고 나머지는 모두 증가하였다. 참당귀 뿌리의 항산화 활성 19%에 비해 A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus 발효 당귀에서 각각 46, 49 및 56%로 모두 2배 이상 증가하였다. Fe- 및 Cu-환원력은 참당귀 뿌리보다 발효 당귀에서 모두 낮아지는 경향을 보였다. Tyrosinase 저해 활성은 당귀 뿌리의 18%에 비해 A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus 발효 당귀에서 각각 34, 37 및 45%로 발효에 의해 2배 이상 증가하였다. 이상의 실험결과 발효 당귀에서 대표적인 화합물인 decursin과 decursinol angelate 함량이 증가하고, 항산화 활성 및 tyrosinase 저해 활성이 증가됨으로서 이를 활용한 건강기능 제품 개발 가능성이 높아졌으며, 이러한 제품 개발에 필요한 기초 자료를 제공해주는데 유용하게 사용될 것이다.
발효방법에 따른 청국장의 휘발성 성분을 비교 조사하기 위해 증자대두에 Bacillus subtilis를 접종시킨 시험구(I), 1차 종균으로서 Lactobacilli(ll) 혹은 Aspergillus oryzae(III)를 접종시켜 소정시간 발효후 Bacillus subtilis를 추가 접종시킨 시험구, 그리고 볏짚을 접종원으로 한 시험구(IV)의 청국장제품을 각각 연속증류추출장치를 사용하여 휘발성 성분을 추출 농축하고 GC와 GC/MS를 이용하여 휘발성 성분을 분석 동정하였다. 그 결과 Bacillus subtilis 단용 발효구(I)와 볏짚을 접종원으로 사용한 시험구(IV)에서 각각 35종과 46종의 휘발성 성분이 검출되었고 Lactobacilli처리구(II)에서는 29종의 휘발성 성분이 검출되었는데 시험구(I), (IV)에 비해 향미성분으로 알려진 2,3,5-trimethyl pyrazine, 2,5-dimethyl pyrazine 등의 함량이 각각 2.2배, 1.5배 증가되었다. 또한 Asp. oryzae처리구(III)에서는 총 36종의 휘발성 성분이 분리 동정되었고 이들 성분 중에서 hexadecanoic acid, 2-methyl pyrazine성분이 많이 검출된 반면 청국장의 불쾌취로 알려진 butyric valeric acid는 검출되지 않았다. 대두 품종별로 제조한 청국장의 휘발성 성분을 비교 검토한 결과 신팔달콩을 원료대두로 사용한 시험구의 청국장이 향미성분은 증가한 반면 불쾌취 성분은 감소되었다.
자돈사료내 Aspergillers oryzae를 주 균주로 하는 생균제제인Natufermen$^{(R)}$을 첨가시 생산성 및 분중 암모니아 발생량, 영양소 소화율, 혈청내 IgG, 분중 미생물 균총의 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 6주간의 실험을 실시하였다. 이유자돈 48두(3원교잡종(Y${\times}$L${\times}$D), 평균 초기체중 7kg$\pm$0.05)를 4처리 4반복 반복당 3두씩 배치하여 6주간 사양실험을 실시하였다. 시험 처리는 대조구(C), $C^+$Natufermen$^{(R)}$ 0.1%, $C^+$Natufermen$^{(R)}$ 0.2%, $C^+$Natufermen$^{(R)}$ 0.3% 이었다. 6주간의 사양성적에서 일당 증체량은 Natufermen$^{(R)}$ 첨가구들이 대조구에 비해 모두 증가하는 경향을 나타내었으나 유의적 차이는 나타나지 않았고 사료효율은 0.2% Natufermen 첨가구에서 대조구에 비해 유의적으로 개선되었다(P<0.05). 영양소 소화율에서는 건물, 회분, 인의 소화율이 Natufermen$^{(R)}$ 첨가구들 모두 유의적으로 증가하였으며 조단백질 소화율에서도 증가하는 경향을 나타냈다. 혈청내 IgG 농도는 Natufermen$^{(R)}$ 첨가 수준이 증가함에 따라 유의적으로 감소하였다. 실험 3주째 Natufermen$^{(R)}$ 0.1%, 0.2% 첨가구에서 대조구에 비해 분중 Lactobacilli가 유의적으로 증가하였다. 결론적으로 자돈사료내 Natufermen$^{(R)}$ 첨가는 사료효율을 개선시키며 건물, 조회분, 인의 소화율을 증가시키며, 분중 Lactobacilli 균총을 증가시켰다. 혈액내 IgG 수준은 Natufermenv$^{(R)}$의 수준이 높아질수록 낮아졌다.
대두를 $25^{\circ}C$에서 48시간 발아시킨 콩을 원료로 볏짚, Bacillus natto, B. natto와 Aspergillus oryzae 혼합균을 접종하여 제조한 청국장과 비발아콩 볏짚으로 제조한 청국장의 발효 중 미생물 및 효소활성도 변화를 조사하고 관능평가를 실시하였다. 4종류의 청국장 모두 발효가 진행되면서 pH가 서서히 증가하여 최대 pH를 보인 이후 다시 감소하여 발효 72시간에는 비발아콩 볏짚 청국장>발아콩 볏짚 청국장>혼합균주를 이용한 발아콩 청국장>B.natto를 이용한 발아콩 청국장 순으로 높은 pH를 나타내었다. 청국장 발효 중 미생물의 변화는 세균의 경우 모든 청국장에서 발효가 진행됨에 따라 급격히 증가하여 발효 12시간에 $10^7-10^8$ CFU/g를 나타내었으나 그 이후에는 발효시간에 따라 큰 변화를 나타내지 않았다. 곰팡이 수는 B. natto를 접종한 발아콩 청국장을 제외하고는 발효 48-60시간에 $10^8$ CFU/g로 최대값을 나타낸 이후 감소하였으며, B. natto를 접종한 청국장은 발효시간에 따라 지속적으로 증가하여 발효 72시간에 $10^8$ CFU/g을 나타내었다. Protease활성은 발효가 진행됨에 따라 acidic과 neutral protease 활성 모두 증가하였으며 neutral protease의 활성도가 acidic protease에 비해 높았다. 이는 청국장 발효과정 중 neutral protease의 최적 활성 pH인 7.0 부근으로 청국장의 pH가 변화했기 때문인 것으로 사료된다. ${\alpha}$-Amylase 활성도의 경우 혼합균주를 이용한 발아콩 청국장을 제외하고는 발효가 진행됨에 따라 전반적으로 감소하는 경향을 보였으며, ${\beta}$-amylase 활성도는 혼합균주를 이용한 발아콩 청국장을 제외한 다른 3 종류의 청국장에서 발효 12시간에 최대활성을 나나타낸 이후 감소하였다. 관능검사 결과 냄새와 향기에 있어서 비발아콩 볏짚 청국장의 선호도가 높은 것으로 나타났으나 전체적인 기호도는 B. natto와 A. oryzae를 이용한 발아콩 청국장과 비발아콩 볏짚 청국장이 유사하게 높게 나타났다.
본 연구는 A. oryzae를 접종하여 제조한 콩알메주 된장에 단백질 분해효소를 처리한 후 아미노태 질소, 유리아미노산 등 품질특성 변화를 조사하였다. 콩알메주 된장의 수분함량 및 pH는 단백질 분해효소 첨가 된장이 무첨가 된장보다 낮은 결과를 보였고, 염도와 색도는 단백질 분해효소에 따른 변화가 없었으며, 적정산도, 환원당 및 아미노태 질소는 단백질 분해효소 첨가 된장이 무첨가 된장보다 높은 결과를 보였다. ${\alpha}$-amylase 효소활성은 Aspergillus속 유래 단백질 분해효소 단독 및 혼합처리 된장의 경우 발효 4주차에 가장 높은 활성을 보인 반면, 단백질 분해효소 무첨가 된장은 거의 활성을 나타내지 않았고, protease 효소활성은 단백질 분해효소를 첨가한 된장의 경우 무첨가 된장보다 약 4배 높은 활성을 보였다. 무첨가 된장에 비해 단백질 분해효소처리 된장에서 Protease A 처리 시 arginine, lucine, tryptophan, phenylalanine 등 4종, Protease B 처리 시 histidine, serine, glycine, threonine, proline, isoleucine, lucine, phenylalanine 등 8종, Protease A+B 혼합처리 시 histidine, serine, glycine, threonine, proline, tryptophan, isoleucine, lucine, phenylalanine 등 9종의 유리아미노산이 증가하였다. DPPH 라디칼 소거 활성과 총 폴리페놀함량은 단백질 분해효소 첨가 된장의 경우 무첨가 된장보다 높은 값을 보였고, 총 균수와 곰팡이 수는 단백질 분해효소의 첨가 유무와 상관없이 발효가 진행됨에 따라 감소하였다. 이상의 결과를 종합하여 A. oryzae 접종 콩알메주 된장의 제조 시 단백질 분해효소를 첨가하여 발효시킬 경우 효소에 의해 환원당, 아미노태 질소 함량과 항산화능이 증가하고, ${\alpha}$-amylase와 protease 등 효소활성이 높아 된장의 발효기간을 단축시키면서 맛과 품질 개선에 도움이 될 것으로 기대된다.
To investigate non-aflatoxin-production of A. oryzae at the molecular level, an aflatoxin biosynthesis gene homolog cluster of RIB 40 was analyzed. Although most genes in the corresponding cluster exhibited from 97 to 99 % similarity to those of Aspergillus flavus, three genes shared 93 % similarity or less. In addition, although slight expression of aflR, positive transcriptional regulator gene, was detected in some A. oryzae strains having seven aflatoxin biosynthesis homologous genes, other genes related to aflatoxin production were not detected. RIB strains were mainly divided into group 1, having seven aflatoxin biosynthesis homologous genes (aflT, nor-i, aflR, norA, avnA, verB, and vbs), and group 2, having three homologous (avnA, verB, and vbs). Partial aflatoxin homologous gene cluster of RIB62 from group 2 was sequenced and compared with that of RIB40 from group 1. RIB62 showed a large deletion upstream of ver-1 with more than half of the aflatoxin homologous gene cluster missing including aflR, a positive transcriptional regulatory gene. Adjacent to the deletion of the aflatoxin homologous gene cluster, RIB62 has a unique sequence of about 8kb and a telomere. Southern analysis of A. oryzae RIB strains with four kinds of probe derived from the unique sequence of RIB62 showed that all group 2 strains have identical hybridizing signals. Polymerase chain reaction with specific primer set designed to amplify the junction between ver-1 and the unique sequence of RIB62 resulted in the same size of DNA fragment only from group 2 strains. Based on these results, we developed a useful genetic tool that distinguishes A. oryzae group 2 strains from the other groups' strains and propose that it might have differentiated from the ancestral strains due to chromosomal breakage.
메주의 산업화를 위해, 종균으로서는 A. oryze와 A. sojae 그리고 B. subtilis를 병용하고, 습도조절과 함께 $28^{\circ}C$에서 12일간 발효하면서 메주의 품질특성 변화를 조사하였다. 그리고 이들 종균 접종 메주와 순창 고추장 민속마을에서 입수한 된장용 전통메주의 효소 활성도를 비교하였다. 즉, A. oryzae를 접종한 메주(=AO메주), A. oryze와 B. subtilis를 접종한 메주(AOBS메주), A. sojae를 접종한 메주(=AS메주), A. sojae와 B. subtilis를 접종한 메주(=ASBS메주)를 12일 동안 발효시키면서 메주별로 품질 변화를 관찰하였다. 세균수와 곰팡이수는 각각 발효초기 6.48~6.69 log cfu/g, 5.00~5.71 log cfu/g에서 발효 2일에 8 log cfu/g 이상, 6 log cfu/g 이상으로 증가한 후 발효 12일 까지 세균수는 유지되었고, 곰팡이수는 감소 경향을 보였다. 아미노태 질소 함량은 발효 2일에 430.5~577.5 mg% 범위를 나타내었다. 중성 protease 활성도는 전통메주 $1,258.0{\pm}38.8$, AS메주 $1,238.3{\pm}38.6$, AO메주 $1,204.1{\pm}24.1$, ASBS메주 $1,040.6{\pm}10.6$, AOBS메주 $1,033.5{\pm}11.2$ unit/g순으로 나타났다. 산성 protease활성도는 AO메주 $1,030.1{\pm}19.1$, 전통메주 $1007.7{\pm}30.5$, AS메주 $990.9{\pm}25.0$, AOBS메주 $910.9{\pm}15.3$, ASBS메주 $888.2{\pm}15.7$ unit/g 순이었다.
재래식메주에 있어서 자연서식한 microflora의 상태에 따라 외부(外部) 내부(內部) 외부(外部)와 내부(內部)의 혼합으로 각각 3구의 재래식 고추장을 담가 숙성과정중의 제화학성분 및 미생물의 동태(動態)를 조사하고 숙성과정에 관여한 미생물을 순수분리하여 이들의 효소활성을 screening하여 우수균주를 선정 및 동정 하였으며 효소적 특성을 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 제화학 성분변화 (1) pH의 변화는 숙성 10일에 급격히 강하하였고 숙성 60일까지 점차 완만한 감소를 보이다가 그 이후는 약간 증가하였다. 메주외부고추장구(區)의 pH가 가장 낮았으며 메주내부고추장구(區)의 메주혼합고추장구(區)의 pH는 서로 비슷하였다. (2) 총산의 면화는 숙성 60일까지 3구(區) 공히 서서히 증가하다가 그 이후 점차 감소하였다. (3) 총질소의 변화는 숙성 60일까지 3구(區) 공히 점진 증가하다가 그후 약간 감소하였다. (4) Trichloroacetic acid에 가용(可容)인 질소의 변화는 숙성 10일에 3구(區) 공히 급격히 증가하였고 그후는 완만한 증가를 보였다. (5) amino태(態) 질소의 변화는 숙성 30일까지 3구(區) 공히 크게 증가하다가 그 이후는 완만하게 증가하였다. (6) 환원당의 변화는 숙성 50일까지 3구(區) 공히 증가하다가 그 이후는 서서히 감소하였다. 2. Microflora의 변화 (1) 호기성세균군(群), 혐기성세균군(群), mold군(群)의 변화는 숙성 $30{\sim}40$일까지 3구 공히 증가하였으나 그 이후는 감소하는 경향이었다. (2) Yeast군(群)의 변화는 3구 공히 숙성 20일까지는 보이지 않다가 pH가 5.4이하로 강하된 때부터 나타나기 시작하며 메주내부 고추장구(區)에서 처음에는 많이 나타났으나 점차로 감소하였고 메주 외부고추장구(區), 메주혼합고추장구(區)는 처음에는 적게 나타났으나 점차로 증가하였다. 3. 효소활성이 우수한 균주 및 그 효소특성 (1) amylase와 protease를 분비하는 우수균주는 Bacillus subtilis-P, Bacillus subtilis-G, Bacillus licheniformis-K, Aspergillus oryzae-B로 동정되었다. (2) amylase activity가 가장 강한 것은 Aspergillus oryzae-B였고 그 다음이 Bacillus subtilis-P Bacillus licheniformis-K, Bacillus subtilis-G의 순서였다. protease activity에 있어서는 Aspergillus oryzae-B와 Bacillus subtilis-P가 거의 비슷하게 우세하였고 Bacillus licheniformis-K, Bacillus subtilis-G의 순서였다. (3) 효소활성에 대한 식염농도 영향은 amylase가 protease보다 식염에 의한 저해를 많이 받고 있어서 고추장 식염농도인 15% NaCl에서 amylase activty는 $45{\sim}65%$, protease activity는 $40{\sim}46%$의 저해를 받았다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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