난백 단백질 중 ovotransferrin을 gel chromato- graphy와 heparin affinity chromatography를 통하여 분리 하였다. 1차 gel filtration의 경우에 샘플인젝션 후 65-70min(fraction No. 14) 이후에는 ovalbumin이 ovotransferrin과 혼입되어 분리되고 오히려 ovalbumin의 농도가 더 높은 분포를 보였다. 고순도의 ovotransferrin을 분리하기 위하여 다시 fraction No. 12-14을 농축한 뒤 gel filtration을 실시한 결과 ovotransferrin이 완전히 분리되지 않았는데 이는 gel filtration만의 반복을 통해서 순수한 ovotransferrin을 얻는 것이 비효과적임을 의미하는 것으로 판단된다. Ovotransferrin을 heparin affinity chromatography을 이용하여 분리한 경우 칼럼에 Fe2+를 고정시킨 후 50mM EDTA를 흘려 주었는데 ovalbumin이 5-10분경에 용출이 되었고 10-15분경에 ovalbumin과 ovotransferrin이 같이 용출되었다. 그 후에 50mM Phosphate buffer (pH 7.2, 0.15M salt)를 흘려주었는데 여전히 ovalbumin의 밴드가 보여 순수하지 않음을 확인하였다. Fe3+를 컬럼에 고정시킨 후 50mM EDTA를 흘려주었을 때 ovalbumin이 10-15분경에 용출이 되었고 15-20분경에 ovalbumin과 ovotransferrin이 같이 용출되었지만 50mM Phosphate buffer (pH 7.2, 0.15M salt free)를 흘려주었을 때 156-165분경에 ovalbumin이 혼입되지 않은 매우 순수한 ovotransferrin이 용출되는 것을 확인하였다. 위의 결과를 종합해볼 때 gel chromatography를 반복적으로 실시한 경우 보다는 heparin affinity chromatography를 이용하여 분리하고 컬럼에 Fe2+를 고정시킨 경우보다 Fe3+를 고정시켰을 때 더욱 순수한 ovotransferrin을 분리해낼 수 있었다.
실리카 입자를 기공 형성제로 사용하여 물리적 강도와 단백질 결합용량이 높은 다공성 키토산 및 키틴 친화 막을 제조하였다. 키토산 친화 막의 BSA 단백질 결합용량은 최대 21.8mg/mL이었으며, 키틴 친화 막의 lysozyme 효소 결합용량은 최대 26.1mg/mL이었다. 제조된 다공성 키토산 및 키틴 친화 막을 사용하여 단백질 용액의 loading 유량, loading 양 및 농도 변화에 따른 BSA와 lysozyme의 친화 막 여과 크로마토그래피 분리 실험을 수행하였다. 친화 막 여과 크로마토그래피 분리 실험을 통해 얻어진 loading/washing/elution의 단계로 구성된 일련의 크로마토그램으로부터 단백질 용출량과 결합수율을 구하였다. 키토산 및 키틴 친화 막에의 BSA 및 lysozyme 단백질의 결합량과 결합수율은 loading용액의 유량이 작을수록, 주입량 및 농도가 클수록 증가하였다. 이 결과로부터 실리카 입자를 기공 형성제로 사용하여 제조된 다공성 키토산 및 키틴 막은 단백질의 대규모 여과 크로마토그래피 분리를 위한 친화 막으로서 효과적인 활용이 기대된다.
The steroid 9${alpha}$-hydroxylase activity has been detected in cytosol fraction, $100,00{\times}g$ supernatant of cell free extract of Mycobacterium fortuitum. The activity was not linear with protein concentration in the assay suggesting 9${alpha}$-hydroxylase is a multicomponent enzyme. The 9${alpha}$-hydroxylase system was partially purified through fractional saturation of ammonium sulfate, strong anion exchange (Mono Q) column chromatography, gel filtration (Superose 12) column chromatography, and testosterone affinity gel chromatography. Ammonium sulfate 50~60% saturated fraction of the cytosol gave 9${alpha}$-hydroxylase activity. For further purification, the half-saturated ammonium sulfate fraction was applied to Mono Q, Superose 12, or affinity gel column. The purification factors of 9${alpha}$-hydroxylase containing fraction after Mono Q, Superose 12, and affinity gel chromatography was 13, 11, and 17 respectively.
Famesyl protein transferase involved in the first step of post-translational modification of $p21^{ras}$ proteins transfers the famesyl moiety from famesyl pyrophosphate to a cysteine residue in $p21^{ras}$ proteins. The enzyme was first purified 30,000-fold from bovine testis by use of 30~50% ammonium sulfate fractionation, DEAE-Sephacel ion exchange chromatography, Sephacryl S-300 gel filtration chromatography, Sephacryl S-200 gel filtration chromatography, and hexapeptide (Lys-Lys-Cys-Val-Ile-Met) affinity chromatography. The molecular weight of the purified enzyme was estimated to be ~100 kDa by gel filtration and SDS-polyacrylamide gels showed two closely spaced bands of ~50 kDa protein. These indicate that the enzyme consists of two nonidentical subunits, a and 13, which have slightly different molecular weights. The enzyme was inhibited by hexapeptide (Lys-Lys-Cys-Val-Ile-Met), which acted as an alternative substrate that competed for famesylation. Kinetic analysis by measuring initial velocities showed that famesyl protein transferase is a very slow enzyme. EDTA-treated famesyl protein transferase showed little activity with $Mg^{2+}$ or $Zn^{2+}$ alone, but required both $Mg^{2+}$ and $Zn^{2+}$ for the catalytic activity.
한국막학회 2004년도 Proceedings of the second conference of aseanian membrane society
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2004
Affinity membranes have emerged principally to overcome the problems of limited specificity experienced with membranes that operate purely on a sieving mechanism and as an alternative to the traditional affinity resins. It is a logical expectation that affinity membranes might combine the outstanding selectivity of affinity resins with the high productivity associated with filtration membranes.(omitted)
실리카 입자를 기공 형성제로 사용하여 다공성 키토산 및 키틴 막을 제조하였다. 다공성 막의 제조는 다음의 3단계 절차로서 수행되었다: (1) 키토산 용액에 실리카 입자를 첨가시켜 필름을 형성시킨 후, (2) 이 필름을 알카리 용액에 침지시켜 실리카 입자를 제거하여 다공성의 키토산 막을 제조하였으며, (3) 다공성 키토산 막을 acetic anhydride를 사용하여 아세틸화시킴으로서 다공성 키틴 막을 제조하였다. 물리적 강도가 우수하고, 적절한 순수 투과량을 갖는 다공성 키토산 막과 키틴 막의 최적 제막조건이 제시되었다. 단백질 친화성을 부여하기 위해 다공성 키토산 막에 반응성 염료인 Cibacron Blue 3GA를 고정화시켰으며, BSA 단백질 및 lysozyme 효소의 흡착실험을 수행하여 친화 키토산 막 및 키틴 막의 단백질 결합용량을 측정하였다. 친화 키토산 막의 BSA 단백질 결합용량은 약 22 mg/mL이었으며, 친화 키틴 막의 lysozyme 효소 결합용량은 약 26 mg/mL로서 이는 키토산 또는 키틴을 기반으로 하여 제조된 hydrogel bead의 단백질 결합용량보다 수${\sim}$수십 배 큰 값으로서, 향후 막여과 크로마토그래피용 친화 막으로의 효과적인 활용이 기대된다.
우리나라 재래종인 한우의 초유로부터 lactoferrin(Lf)을 분리하기 위해서 batch extraction, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography 등의 정제과정을 실시하였다. 각 정제 단계에 의해 한우 Lf과 결합되어 있던 여러 물질들이 제거되었으며 한우 초유 1 liter에서 정제과정을 통하여 회수한 Lf의 양은 65mg로 회수율이 29.4%였다. SDS-PAGE와 HPLC를 이용해 확인한 결과, 정제 단계를 거침에 따라 순도가 높아지는 것 알 수 있었다. 정제된 한우 Lf은 분자량이 81 kDa 이고 등전점은 pI 9였으며, 철 함량이 0.56mg/g으로 철 포화도는 약 40.6%로 측정되었다. 한우 Lf과 젖소 Lf은 아미노산 조성과 ${\alpha}$-helix 함량에서 서로 다르게 나타났다. E. coli O111에 대한 항균성은 젖소 Lf이 한우 Lf 보다 높았으며, 최소저해농도(MIC)는 젖소 Lf이 1.5mg/ml, 한우 Lf은 2.75mg/ml로 젖소 Lf의 항균 활성이 더 높은 것으로 나타났다.
For the production and purification of a single chain human insulin precursor, four types of fusion peptides $\beta$-galactosidase (LacZ), maltose binding protein (MBP), glutathione-S-transferase (GST), and (His)(sub)6-tagged sequence (HTS) were investigated. Recombinant E. coli harboring hybrid genes was cultivated at 37$\^{C}$ for 1h, and gene induction occurred when 0.2mM of isopropyl-D-thiogalactoside (IPTG) was added to the culture broth, except for E. coli BL21 (DE3) pLysS harboring a pET-BA cultivation with 1.0mM IPTG, followed by a longer than 4h batch fermentation respectively. DEAE-Sphacel and Sephadex G-200 gel filtration chromatography, amylose affinity chromatography, glutathione-sepharose 4B affinity chromatography, and a nickel chelating affinity chromatography system as a kind of immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) were all employed for the purification of a single chain human insulin precursor. The recovery yields of the HTS-fused, GST-fused, MBP-fused, and LacZ-fused single chain human insulin precursors resulted in 47%, 20%, 20%, and 18% as the total protein amounts respectively. These results show that a higher recovery yield of the finally purified recombinant peptides was achieved when affinity column chromatography was employed and when the fused peptide had a smaller molecular weight. In addition the pET expression system gave the highest productivity of a fused insulin precursor due to a two-step regulation of the gene expression, and the HTS-fused system provided the highest recovery of a fused insulin precursor based on a simple and specific separation using the IMAC technique.
Pleurotus ostreatus로부터 glyoxalase I(S-lactoyl-glutathione methylglyoxal lyase, EC 4.4.1.5)이 S-hexylglutathione affinity chromatography, Sephadex G-150 gel permeation chromatography, DEA-sepharose A-50 CL-6B ion exchange chromatography를 통해 순수 분리되었다. 이 결과, 전체 활성도의 21.7% fmf 수확하였으며, 분리 배수는 2,294 배 이었다. Gel filtration chromatography로 측정한 효소의 분자량은 34 kDa이며, SDS-PAGE 결과 본 효소는 분자량 17 kDa인 동일한 소단위체 두 개로 구성된 이합체라고 생각된다. Methylglyoxal과 phenylglyoxal에 대한 $K_m$ 값은 각각 0.39 mM 과 0.22 mM 이며 L-xylosone과 hydroxypyruvaldehyde에 대해서도 강한 친화력을 보여주었고, pH 6.5~7.5, $35~45^{\circ}C$에서 활성도가 가장 높았다. 이 효소의 반응 과정을 핵자기공 명분광법으로 분석한 결과, 분자내의 양성자 전달과정이 뚜렷이 관찰되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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