식물생장조절제의 종류와 농도를 모색하여 할미꽃의 발근 최적 조건을 조사하여 정상적인 재분화체를 획득하고자 하였다. 지금까지의 선행연구를 토대로 최적조건에서 shoot를 유도시킨 후 발근 유도 생장조절제에 바로 옮기면 shoot가 너무 작아 재분화체가 성장하지 못하고 고사되었다. 1/2 MS에서 키운 shoot를 3.0 mg/L NAA를 첨가한 배지에서 3일간 생장시킨 후, 1/3 MS로 옮겨 치상 한 경우, 약 10일 전후에 뿌리의 유도가 관찰되었다. 이렇게 뿌리가 유도된 재분화체는 염의 농도와 설탕의 농도를 동시에 순차적으로 낮추어 순화처리되었다.
Methylglyoxal bis-(guanylhydrazone)[MGBG]과 polyamine이 부정근 형성시 탄수화물 대사에 미치는 영향을 알아보고자 대두 자엽 절편을 이용하여 $5{\times}10^{-6}\;M\;NAA와\;5{\times}10^{-7}M$ kinetin으로 조성한 부정근 형성구에 $10^{-3}M$ MGBG와 이 MGBG에 $10^{-5}M$의 putrescine, spermidine 및 spermine을 각각 혼합 처리하여 전분 및 수용성당의 함량 변화와 함께 관련 효소의 활성도 변화를 조사하였다. 전분 및 maltose와 sucrose 함량은 대조구가 가장 낮았으며, MGBG를 포함하는 모든 처리구가 대체로 높게 나타났다. Glucose 함량 변화는 시차는 있으나 대조구와 spermine 동시 처리구가 유사하여 증가 후 감소하였으며 MGBG 처리구는 감소 후 증가하였다. Amylase의 활성은 대조구와 MGBG 처리구에서 유사한 양상을 나타내어 지속적으로 증가하였으며 maltase의 활성은 대조구에서 가장 높았고 invertase의 활성은 큰 변화가 없었다.
olyamine 합성 저해제와 polyamine이 부정근 형성에 미치는 영향을 알아보고자 대두 자엽 절편을 이용하여 5$\times$$10^{-6}$ M NAA와 5$\times$$10^{-7}$ M kinetin으로 조성한 부정근 형성 배지에 polyamine 합성 저해제와 Polyamine을 처리하여 Polymine 저해제에 의한 부정근 형성 억제와 부정근 형성능회복을 조사하였다. 부정근 형성 배지에 $\alpha$-difluoromethylornithine (DFMO), $\alpha$-difluorornethyla.ginine (DFMA), cyclohexyl ammonium sulfate(CHA), dicyclohexylamine(DCHA) 및 methylglyoxal-bis (guanylhydrazone) (MGBG)등의 polyamine 합성 저해제를 $10^{-4}$ -$10^{-2}$ M농도로 단용 또는 혼용 처리한 결과 $10^{-3}$ M MGBG에서 부정근 형성이 가장 억제되었으며 $10^{-3}$ M MGBG에 각 Polyamine을 처리한 결과 spermine $10^{-5}$ M을 동시 처리시 부정근 형성능이 다소 회복되었다. Polyamine 함량은 대조구에 비하여 각 실험구에서 배양 초기에 급격히 증가하였으며 spermine 동시 처리구에서 각 polyamine 함량의 증가가 가장 현저하였다.
부정근발생에 관한 도립 및 직립배양의 영향을 구명하기 위하여 6일간 자란 팥의 유경 절편을 사용하였다. $2\times10$^{-4}M$ IAA 용액을 48시간 처리할 때에 절편의 위치를 직립 또는 도립으로 배양 후 96시간 직립으로 배양하였다. 48시간 처리시 직립배양하면 부정근의 형성은 형태학적 기부에서만 발생하지만, 도립 전처리 배양을 하면 유경절편의 양끝에서 부정근이 발생하였다. IAA 전처리는 절편의 방향과 관계없이 부정근 형성을 촉진시켰다. 부정근 발생시기에 유경절편내의 생화학적 변화를 구명하기 위하여 직립배양 및 도립배양을 한 후 부정근 발생 단계별로 24시간, 48시간, 148시간 후 절편을 상부, 중부, 하부로 등분하여 부정근 발생에 수반되는 효소활성, 절편의 길이 신장 및 생중량을 측정하였다. 절편의 길이 신장은 절편의 상부에서 높게 나타났고 생중량은 발근부위에서 높게 나타났다. peroxidase을 catalase 활성은 부정근원기의 형성단계인 24시간에 절편의 발근부위에서 높게 나타났고 이에 비해 IAA oxidase는 양쪽 기부에서 낮았다. 그리고 IAA oxidase와 peroxidase 활성은 48시간 배양인 부정근의 형성동안 발근 부위에서 감소하였다. 도립전처리 유경 절편에 따라서 효소활성의 변화가 일어났으며 peroxidase의 활성은 부정근원기형성과 밀접한 관계를 나타내었다. 따라서 생화학적인 변화는 유경의 발근영역에서 IAA의 수준의 변화와 밀접하게 관련되어 특정부위에서의 부정근 형성을 유도하는 것으로 판단된 것이다.
Plant regeneration of Pulsatilla koreana was achieved via adventitious shoot formation indirectly from callus and directly from adventitious root segments. For the callus induction from leaf or petiole explants, combination of 2,4- dichlorophenoxyaceticacid (2,4-D) with $2.22\;{\mu}M$ 6-benzyladenine (BA) was effective. Adventitious shoot induction from callus was enhanced by the combined treatment with $0.1\;{\mu}M$ polyvinylpyrrolidone (PVP) compared to cytokinin treatment alone. Adventitious roots were induced from the petiole segments on 1/2 MS medium with $4.93\;{\mu}M$ IBA. High frequency direct adventitious shoot formation from the segments of adventitious roots was achieved on medium with $4.92\;{\mu}M$ 2-isopentenyladenine (2-ip). Elongated shoots were rooted on half-strength MS medium containing $5.71\;{\mu}M$ indole acetic acid (IAA). Regenerated plantlets with well-developed shoots and roots were successfully transferred to soil. This in vitro propagation protocol might be useful for mass propagation as well as conservation of this plant.
Biological activities of decursin and decursinol, natural coumarin derivatives, on the germination, growth and adventitious root formation of several plants were observed. In 10 ppm of decursin or decursinol, the growth of Avena coleoptile sections was inhibited, and the activity of IAA-oxidase was gradually enhanced by the increase of its concentrations. Inhibition effect on seed germination was observed from 100 ppm of each chemcials, and the activity of amylase in the germinating seeds was also gradually decreased. However, in the higher concentrations of decursin, the inhibited germination rate of wheat was slightly reduced. Decursin and decursinol also promoted the adventitious root formation in seeds of Phaseolus vulgaris.
본 연구는 기내에서 발아된 까마중 유식물체의 조직별로 신초 및 뿌리 유도를 통해 효율적인 재분화 조건을 확립하고자 실시하였다. 신초 형성은 식물체 부위별로 서로 달랐으며, 잎에서의 신초 형성빈도가 자엽이나 하백축 그리고 상배축보다 높았다. 절편체당 신초의 수는 잎과 자엽에서 다소 많았으며, 신초의 길이도 다른 부위에 비해 잎과 자엽에서 빠른 증식과 신장을 나타내었다. 특히, 2.0 mg $L^{-1}$ BAP가 첨가된 배지에서 재분화율, 신초의 수와 길이가 증가하여 2.0 mg $L^{-1}$ BAP가 고빈도 신초의 유도 및 생장에 효율적인 것으로 판단되었다. 뿌리분화는 IBA와 IAA가 NAA보다 더 효과적인 것으로 나타났으며, 0.05 mg $L^{-1}$ IAA가 첨가된 배지에서 뿌리 형성율이 90%이며, 뿌리의 갯수와 길이도 각각 평균 4.0개와 7.82 cm로 가장 양호하게 나타났다. 더욱이 배양토에 이식한 재분화체는 100%의 생존율을 보였으며 정상적인 식물체로 생장하였다. 이러한 결과를 토대로 2.0 mg $L^{-1}$ BAP 조건에서의 잎 절편에서 다발성 신초 유도, 그리고 0.05 mg $L^{-1}$ IAA 조건에서의 뿌리형성 유도가 까마중의 대량번식을 위한 최적의 조건임을 알 수 있었다.
애기장대 (Arabidopsis thaliana)생태종 'Columbia'의 잎절편 배양시 부정근, 모용 및 캘러스 형성에 미치는 에틸렌의 역할을 알아보고자 ACC, ethephon, CoCl$_2$및 AgNO$_3$의 영향을 조사하였다. 애기장대 잎 절편을 부정근 (0.1 mg/L NAA), 모용 (2.0mg/L NAA) 및 캘러스 (10.0mg/L - NAA)를 형성하는 MS 배지 각각에 ACC와 ethephon을 1-100mg/L 처리한 결과 부정근 형성구에서는 부정근이 감소 한 반면 모용이 유기되었고 모용 형성구에서는 모용이 감소한 반면 캘러스가 유기되었다. 또한 CoCl$_2$와 AgNO$_3$를 1-100mg/L 처리한 결과 부정근 형성구에서는 모용 형성 없이 부정근이 증가하였으며, 모용 형성구에서는 모용은 감소한 반면 부정근이 유기되었다. 그리고 캘러스 형성구에서는 ACC, ethephon, CoCl$_2$및 AgNO$_3$처리구 모두에서 캘러스 형성이 억제되면서 모용이 형성되었다.
본 연구는 약용식물자원인 땅꽈리 유식물의 하배축 절편으로부터 부정아 형성을 통한 재분화를 조사하여 효율적인 재분화 조건을 확립하고자 하였다. 신초는 저농도 BAP를 함유하는 MS 배지에서 효과적으로 유도되었다. 신초 유도는 BAP 0.5~1.0 mg/L를 단독으로 또는 NAA 0.1~0.5 mg/L와 함께 처리한 MS 배지에서 활발히 이루어졌으며, 특히 BAP 1.0 mg/L가 포함된 MS 배지가 가장 효과적이어서 다발성 신초가 왕성하게 형성되었다. 유도된 신초를 뿌리 유도 배지로 옮겼을 때, 저농도의 NAA, IBA, IAA에서 뿌리가 잘형성되어 재분화 식물체를 만들어 내기에 적절하였다. 발근 수와 뿌리의 길이는 각각평균 2.0개, 8.0 cm 이상으로 높게 나타났다. 특히, 0.03 mg/L의 NAA, IBA, IAA를 포함한 MS 배지에서 뿌리가 더잘 성장하고, 뿌리의 전체적인 형태도 양호하였다. 그리고, 저농도의 NAA, IBA, IAA를 함유하는 MS 배지에서 새로운 신초의 형성도 잘 이루어져서, 줄기의 수가 2개 이상으로 많이, 그리고 길이는 6.0 cm 이상으로 길게 신장하였다. 배양토에 이식한 재분화 식물체는 100%의 생존율을 보였으며, 모두 정상적인 성체로 생장하였다. 따라서 땅꽈리의 부정아 형성을 이용한 재분화 식물체의 생산은 개체들을 대량 증식할 수 있어 균질한 조원료를 안정적으로 공급하는데 주요 수단이 될 것으로 보인다.
This work was carried out to establish adventitious root culture system in three Panax species (wild-grown P. ginseng, P. quinquefolium, and P. japonicum) to analyze their ginsenoside productivity. Adventitious roots were induced directly from segments of seedlings after cultured on MS(Murashige andSkoog 1962) solid medium containing 3.0 mg/l IBA. Omission of $NH_4NO_3$ from the medium greatly enhanced both the frequency of adventitious root formation and number of roots per explants in all the three Panax species. However, elongation of post-induced adventitious roots was enhanced on medium with $NH_4NO_3$. Two-step culture protocol: $NH_4NO_3$-free medium for first two weeks of culture, followed by $NH_4NO_3$ containing medium for further 4 weeks, greatly enhanced the fresh weight increase of adventitious roots in all the three ginseng species. The fresh weight of adventitious roots was high in P. quinquefolium and low in P. ginseng, followed by P. japonioum regardless of the composition of medium. Pattern and content of ginsenosides in adventitious roots differed among the three Panax species. Total ginsenoside content of adventitious roots in P. quinquefolium, P. ginseng, and p. japonicum was 8.03, 15.7 and 1.2 mg/g dry weight, respectively. Among the three speices, adventitious roots in P. quinquefolium produced hig-hamount of ginsenosides. The pattern of ginsenoside fractions between P. ginseng and P. quinquefolium was similar but the amount of ginsenoside differed between the two, While, in P japonicum, total ginsenoside content was very low and some ginsenosides such as ginsenoside Rb2 and Rf were not detected. Conclusively, we demonstrate that same culture condition was required for induction and elongation of adventitious roots of three ginseng species but growth of adventitious roots and their ginsenoside production were different among them.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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