Vahed, Majid;Motalebi, Ebrahim;Rigi, Garshasb;Noghabi, Kambiz Akbari;Soudi, Mohammad Reza;Sadeghi, Mehdi;Ahmadian, Gholamreza
Journal of Microbiology and Biotechnology
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v.23
no.11
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pp.1519-1528
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2013
Bacillus pumilus SG2, a halotolerant strain, expresses two major chitinases designated ChiS and ChiL that were induced by chitin and secreted into the supernatant. The present work aimed to obtain a mutant with higher chitinolytic activity through mutagenesis of Bacillus pumilus SG2 using a combination of UV irradiation and nitrous acid treatment. Following mutagenesis and screening on chitin agar and subsequent formation of halos, the mutated strains were examined for degradation of chitin under different conditions. A mutant designated AV2-9 was selected owing to its higher chitinase activity. To search for possible mutations in the whole operon including ChiS and ChiL, the entire chitinase operon, including the intergenic region, promoter, and two areas corresponding to the ChiS and ChiL ORF, was suquenced. Nucleotide sequence analysis of the complete chitinase operon from the SG2 and AV2-9 strains showed the presence of a mutation in the catalytic domain (GH18) of chitinase (ChiL). The results demonstrated that a single base change had occurred in the ChiL sequence in AV2-9. The wild-type chitinase, ChiL, and the mutant (designated ChiLm) were cloned, expressed, and purified in E. coli. Both enzymes showed similar profiles of activity at different ranges of pH, NaCl concentration, and temperature, but the mutant enzyme showed approximately 30% higher catalytic activity under all the conditions tested. The results obtained in this study showed that the thermal stability of chitinase increased in the mutant strain. Bioinformatics analysis was performed to predict changes in the stability of proteins caused by mutation.
Kim, Yujin;Lee, Kwanghyun;Kim, Hyeonsoo;Cho, Sukhyeong;Lee, Jinwon
Korean Chemical Engineering Research
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v.55
no.3
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pp.363-368
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2017
Methylotrophy is able to use reduced one-carbon compound, such as methanol and methylamine, as a sole carbon source. Methylobacterium extorquens AM1 is the most extensively studied methylotroph utilizing serine-isocitrate lyase cycle. Because the Poly 3-hydroxybutyrate (PHB) synthesis pathway in M. extorquens AM1 is likely to interlink with EMCP (ethylmalonyl-CoA pathway), glyoxylate, and TCA cycles, regulation of PHB production is needed to produce EMCP-derived acid or TCA acids. To adjust carbon flux to PHB production, PhaR, which seems to have function of regulator of PHB synthesis and acetyl-CoA flux, was knocked out in M. extorquens AM1 by using markerless gene deletion methods. As a result, PHB granules were remarkably reduced in the knockout strain ${\Delta}phaR$ compared to parental strain. Although lag phase was extended for 12h, ${\Delta}phaR$ showed similar cell growth and methanol consumption rate compared to wild type.
DNA fragment being able to restore in vitro activity of ${\beta}-1,3-glucan$ synthase was cloned by transformation of the Saccharomyces cerevisiae LP353 mutant strain with genomic library constructed in the YCp50. For the selection of transformants which showed no detectable phenotype linked to recovery of the defect in ${\beta}-1,3-glucan$ synthase activity, the colony autoradiography was succesfully applied. The restriction map of the cloned DNA fragment, which is 8.5-kb in length, was constructed. Both the YEplac195 and the YCp50 carrying the 8.5-kb fragment increased ${\beta}-1,3-glucan$ synthase activity of LP353 by two fold. Neither the YEplac195 nor the YCp50 carrying the 8.5-kb DNA fragment, however, complemented the temperature-dependent osmotic sensitivity which is another distinctive phenotype of LP353. Subcloning experiments indicated that a functional region was located in 4.8-kb BglII-KpnI fragment. The 4.8-kb fragment was also able to increase the level of ${\beta}-1,3-glucan$ content in cell wall as well as the resistance of cells to cell wall lytic enzyme, ${\beta}-1,3-glucanase$. The growth rate of the LP353 with 4.8-kb fragment was almost same as that of wild type strain in liquid medium with 1.2 M sorbitol at nonpermissive temperature. Taken these results together, the 4.8-kb fragment seemed to contain the BGS2 gene for ${\beta}-1,3-glucan$ synthase activity in yeast S. cerevisiae.
In this study, aniline dioxygenase genes responsible for initial catabolism of aniline in Burkholderia sp. HY1 and Delftia sp. HY99 were cloned and the amino acid sequences were comparatively analyzed, which already have been reported as bacteria utilizing aniline as a sole source of carbon and nitrogen, B. sp. HY1 was found to have at least a plasmid, and the plasmld-cured strain, B. sp. HY1-PC obtained using mitomycin C was tested with wild type strain to investigate whether the former maintained the degradability for aniline. This proved that the aniline oxygenase gene from B. sp. HY1 was located in chromosomal DNA, not in plasmid DNA. Aniline dioxygenase small subunits from B. sp. HY1 and D. sp. HY99 were found, based on 146 amino acids, to share 79% similarity. Notably, ado2 genes from B. sp. HY1 and D. sp. HY99 which were found to be terminal dioxygenase of aniline dioxygenase small subunit showed 99% similarity in the deduced amino acid sequences with tdnA2 of Frateuria sp. ANA-18 and danA2 of D. sp. AN3, respectively. Besides, enzyme assay and amino acid sequence analysis of catechol dioxygenase supported the previous report that B. sp. HY1 might occupy ortho-cleavage pathway using catechol 1,2-dioxygenase, while D. sp. HY99 might occupy catechol 2,3-dioxygenase for meta-cleavage pathway.
The stf (Salmonella typhimurium fimbriae) operon consisting of stfA(CDEFG assumes to encode putative fimbriae. The complete stf operon is existed in S. typhimurium and S. choleraesuis, whereas it is absent in S. typhi. Analyses of the amino acid residues between major subunit StfA of the Stf fimbriae and those of known other fimbriaes suggested that Stf belongs to class I type fimbriae. Through comparison of StfD chaperone with the other fimbrial chaperones, and of C-terminus in subunits of Stf fimbriae, it belongs to FGS (with a short Fl-G1 loop) subfamily. In order to investigate the expression of stf operon, we have constructed a Salmonella strain containing a chromosomal stfA::lacZYA transcriptional fusion, resulting in S. typhimurium $_X8532$. The strain $_X8532$ lacked the expression of \beta-galactosidase$ under normal culture conditions. However, with longer incubation time of the S. typhimurium $_X8532$, we have isolated 21 individual strains exhibiting $Lac^+$ phenotype. $Lac^+$ phenotype was appeared as approximately 0.03 frequency per generation. All isolates expressed lacZ constitutively in the various environmental conditions. Various global regulatory proteins including RpoS, OmpR, and CpxR were not involved in the regulation of the stf operon. A S. typhimurium $_X8661$ mutant lacking stfAC function attenuated 6.7 folds more than that of wild type $_X3761$ in the mouse virulence test, suggesting in the somehow involved in the Salmonella pathogenesis.
The phylogenetic relationships among thirty-two strains (P1~P32; including Cordyceps sp., Paecilomyces sp., Beauveria sp., Aranthomyces sp., Isaria sp. and Himenostilbe sp.) in Miryang region located in the southern part of Korea, were investigated based on internal transcribed spacer (ITS) sequences of ribosomal DNA. A fragment of ITS region was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the specific primer pairs ITS1 and ITS4. After obtained same size of PCR products from various strains, we cloned them into a pGEM-T easy vector to determine their sequences. BLAST analyses of the nucleotide sequence ITS1, 5.8S and ITS2 gene fragments revealed the identity and their phylogenetic relationship. Among 32 strains isolated from Miryang region, Cordyceps militaris was shared 100% sequences with Genbank (AY49191, EU825999, AY491992), while some species are not shared perfectly with reported sequences. For example, strain P17 (P. tenuipes in Ulju-gun Gaji Mountain) has some differences among the other strains of P. tenuipes (Miryang-si Jocheon-eup, Miryang-si Gaji Mountain) and those of gene bank. We conclude that ITS analyses with strains in the suburbs of Miryang in this study can be effectively used as a tool for classification, evaluation and collection of the natural eco-type genetic resources.
Lee Sun-Hee;Kim Hee-Kyoung;Hong Sae-Yeon;Lee Yin-Won;Yun Sung-Hwan
The Plant Pathology Journal
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v.22
no.3
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pp.215-221
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2006
Gibberella zeae (anamorph: Fusarium graminearum) is an important pathogen of cereal crops. This fungus produces a broad range of secondary metabolites, including polyketides such as aurofusarin (a red pigment) and zearalenone (an estrogenic mycotoxin), which are important mycological characteristics of this species. A screen of G. zeae insertional mutants, generated using a restriction enzyme-mediated integration (REMI) procedure, led to the isolation of a mutant (Z43R606) that produced neither aurofusarin nor zearalenone yet showed normal female fertility and virulence on host plants. Outcrossing analysis confirmed that both the albino and zearalenone-deficient mutations are linked to the insertional vector in Z43R606. Molecular characterization of Z43R606 revealed a deletion of at least 220 kb of the genome at the vector insertion site, including the gene clusters required for the biosynthesis of aurofusarin and zearalenone, respectively. A re-creation of the insertional event of Z43R606 in the wild-type strain demonstrated that the 220-kb deletion is responsible for the phenotypic changes in Z43R606 and that a large region of genomic DNA can be efficiently deleted in G. zeae by double homologous recombination. The results showed that 52 putative genes located in the deleted genomic region are not essential for phenotypes other than the production of both aurofusarin and zearalenone. This is the first report of the molecular characterization of a large genomic deletion in G. zeae mediated by the REMI procedure.
These studies were carried out to obtain the basic information about transformation of ginseng plant by potential vector system, utilization of opine compound by Agrobacterium sap. , and initiation of crown gall tumor callus. Crown gall tumors were induced from stem of Panax ginseng C.A. Meyer by infection of Agrobacterium tumefaciens. Therefore, it was clarified that transformation of ginseng by Ti plasmid was possible. The crown gall tumors induced by Agrobacterium tumefaciens isolated. from the soil were different in a shape, size, and growth rate. Especially, infection of ginseng by Agrobacterium tumefaciens Y104 led to the amorphic tumor, Tumor tissue derived from stem crown gall could not be continuously cultured on the medium which did not contain phytohormone, and did not form the callus even on the medium supplemented with 2,4-D. On the other hand, the root crown gall tumors formed the calli but the formation rate of callus was quite low. As for the utilization of octopine and nopaline, it was found that 3 strains of Agrobacterium app., Y104, Y110 and C58, utilized nopaline only, Y109 utilized octopine, and Y101 failed to utilize either compound.
Proceedings of the Korean Aquaculture Society Conference
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2003.10a
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pp.36-36
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2003
In the present study, growth performances of the offspring from selected brood line were compared to those of the offspring from non-selected brood line of red sea bream. Offspring groups were mass produced separately from two brood lines, selected and non-selected Korean strain. Selected brood line have been selected by fish size for four generations (upper 5∼30% per generation) and non-selected brood line is the second generation of wild population at south sea in Korea. There's no significant difference in body length between offspring from selected and non-selected brood line during early growing stage (until 96-days old). However, offspring from selected brood line had superior body weight growth than offspring from non-selected brood line. At sea cages rearing trials with communal stocking, Offspring from selected brood line showed significantly better performance in body weight, body length, weight gain, specific growth rate and feed consumption (but not in feed conversion ratio) than offspring from non-selected brood line. At 24 months old, offspring from selected brood line grew faster 1.10 times in body length and 1.41 times in body weight than offspring from non selected brood line. The response to selection when compared to a non-selected line is on average of 10% in weight per generation at 24 months old.
The common split-gilled mushroom, Schizophyllum commune is found throughout the world on woody plants. This study was initiated to evaluate conditions for favorable vegetative growth and to determine molecular phylogenetic relationship in twelve different strains of S. commune. A suitable temperature for mycelial growth was obtained at $30^{\circ}C$. This mushroom grew well in acidic conditions and pH 5 was the most favorable. Hamada, glucose peptone, Hennerberg, potato dextrose agar and yeast malt extract were favorable media for growing mycelia, while Lilly and glucose tryptone were unfavorable. Dextrin was the best and lactose was the less effective carbon source. The most suitable nitrogen sources were calcium nitrate, glycine, and potassium nitrate, whereas ammonium phosphate and histidine were the least effective for the mycelial growth of S. commune. The genetic diversity of each strain was investigated in order to identify them. The internal transcribed spacer (ITS) regions of rDNA were amplified using PCR. The size of the ITS1 and ITS2 regions of rDNA from the different strains varied from 129 to 143 bp and 241 to 243 bp, respectively. The sequence of ITS1 was more variable than that of ITS2, while the 5.8S sequences were identical. A phylogenetic tree of the ITS region sequences indicated that the selected strains were classified into three clusters. The reciprocal homologies of the ITS region sequences ranged from 99 to 100%. The strains were also analyzed by random amplification of polymorphic DNA (RAPD) with 20 arbitrary primers. Twelve primers efficiently amplified the genomic DNA. The number of amplified bands varied depending on the primers used or the strains tested. The average number of polymorphic bands observed per primer was 4.5. The size of polymorphic fragments was obtained in the range of 0.2 to 2.3 kb. These results indicate that the RAPD technique is well suited for detecting the genetic diversity in the S. commune strains tested.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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