• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제25권1호
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• pp.87-92
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• 1998

본 연구는 생쥐 미수정란을 초자화 동결하였을 때, 체내/외 발달율에 미치는 영향을 연구하고자 실시하였다. 생쥐 미수정란은 30, 35, 40% ethylene glycol, 18% ficoll과 0.5 M sucrose가 함유된 M2 배양액으로 구성 된 EFS30, 35, 40을 이 용하여 초자화 동결되었다. 노출 또는 초자화 동결-융해 후, 형태학적으로 정상적인 미수정란은 $1-2\times10^6/ml$ 농도의 정자로 체외수정되었고, 수정 율과 체내/외 발달율 그리고 배 반포의 세포수 (inner cell mass 와 tropectoderm cell)가 조사되었다. 본 실험에서 얻어진 결과는 다음과 같다. 35%의 ethylene glycol이 함유된 EFS35에서 EFS30과 EFS40보다 높은 분할율을 나타냈다. 초자화 동결-융해 후 체외수정된 미수정란의 2-세포기까지의 발달을 (51.1%)은 동결없이 초자화 동결액에 노출만된 군 (60.0%)과 대조군 (68.2%)에 비해 유의하게 감소하였다 (p<0.05). 그러나 이들 처리군에 있어서 난할된 난자로 부터의 배반포기 배까지의 발달율에는 유의한 차가 없었다. (75.0, 73.3 과 80.0%). 또한 초자화 동결된 군의 배반포기배 세포수 $(92.5{\pm}2.9)$도 노출군 $(98.5{\pm}5.3)$, 대조군 $(100.9{\pm}4.8)$과 유사하였다. 초자화 동결-융해 하여 얻어진 배반포기배를 가임신 생쥐에 이식하였을 때 체내발달율인 산자발달율 (50.7%)과 착상율 (80.0%)도, 대조군 (58.2, 78.2%)과 유사하였다. 이러한 결과로 보아, 생쥐 미수정란은 ethylene glycol를 기본으로 한 EFS35라는 초자화 동결액을 이용하여 동결보존될 수 있음을 알 수 있었다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제26권2호
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• pp.231-238
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• 1999

본 연구는 체외생산된 소 배반포기배를 발달 단계 및 배양일에 따라 구별하여 초자화 동결 및 융해하였을 때, 그 발달능을 유지하는지 확인하고자 실시하였다. 체외수정 후 8일간 배양된 배반포기 배는 20% ethylene glycol에 3분 동안 평형시키고, EFS40 (40% ethylene glycol, 18% ficoll, 0.3M sucrose 그리고 10% FBS가 함유된 mDPBS) 동결액에 30초 동안 노출한 후, 액체질소에 침지하여 초자화 동결되었다. 체외 생존 여부는 응해 24시간 및 48시간에 재팽창 및 탈출 또는 완전탈출로써 평가하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 체외수정 후 8일간 배 양하였을 때, 난할된 배의 배반포기 배로의 발달율은 41.0%였다 (초기 ; 7.6%, 팽창; 22.9%, 탈출; 4.6%, 완전탈출; 5.9%). 2) 배반포기배를 동결액에 노출 또는 초자화 동결하였을 때, 초자화 동결된 배반포기배의 재팽창율 (73.3%)은 대조군 및 동결액에 노출된 경우 (100, 97.0%)보다 낮았다 (p<0.05). 그러나 융해 48시간 후 탈출 또는 완전탈출 배반포기배 형성율은 초자화 동결된 경우 (66.7, 46.7%)와 노출된 경우 (66.7, 39.4%)는 유의한 차이를 나타내지 않았으나, 대조군(100, 100%)과는 차이를 보였다 (p<0.01). 그러나, 완전탈출까지 발달한 배반포기배의 총 세포수를 조사하였을 때, 각 처리군간의 유의한 차이는 없었다. 3) 배반포기배의 발달 단계에 따른 체외 생존율을 비교하였을 때, 재팽창율은 실험군간에 유의한 차이를 보이지 않았다 $(64.5{\sim}75.6%)$. 그러나 융해 48시간 후, 탈출 또는 완전탈출로써 평가된 초기 배반포기배의 발달율 (25.8, 9.7%)은 팽창 (69.7, 39.4%)및 탈출 배반포기배 (53.3, 43.3%)의 발달율보다 낮게 나타났다 (p<0.05). 4) 또한, 배양 7, 8 그리고 9일의 팽창 배반포기배를 초자화 동결하였을 때, 8일 및 9일간 배양된 배반포기배의 재팽창율은 7일간 배양된 경우보다 낮게 나타났다 (7일; 93.9%, 8일; 75.8%, 9일; 87.5%) (p<0.05). 그러나 완전탈출 배반포기배로의 발달율에서는 처리군간에 유의한 차이를 보이지 않았다 (7일; 36.4%, 8일; 36.4%, 9일; 31.3%). 이러한 결과는 EFS40을 이용한 2단계 초자화 동결 방법이 체외생산 된 팽창 및 탈출 배반포기배의 동결에 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권2호
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• pp.119-126
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• 1996

본 연구는 30% Ficoll과 0.3M sucrose가 함유된 mDPBS 용액에 40%의 ethylene glycol을 첨가함으로서 제조된 EFS40을 이용하여 1-세포기의 생쥐수정란을 효율적으로 동결할 수 있는 적정 조건을 확립하기 위하여 실시하였다. 체외수정에 의해 생산된 생쥐수정란은 1단계 동결법 혹은 2단계 동결법, 두 가지 동결 방법에 의해 각각 초자화 동결되었으며, 동결 후, 융해된 수정란의 생존율은 2-세포기로 분할율과 배양 5일째 탈출배반포기로의 발달율로 각각 검증하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1단계 동결법에서, 수정란을 직접 초자동결액에 1분 동안 노출시켰을 때, 수정란의 생존율은 85.5%, 발달율은 31.9%였다. 수정란을 먼저 20% ethylene glycol에 1, 3, 5분간 노출시킨 후, 1분동안 EFS40 용액으로 옮겨 동결하는 2단게 동결법에서는 1단게 동결법보다 낮은 생존율을 보였다(65.4, 53.6 및 29.6%). 가장 높은 생존율(95.9%)은 EFS40에서 30초동안 노출이 1단계 동결법에서 얻을 수 있었다. 이 조건하에서 2-세포기로 분할된 수정란의 63.8%가 탈출배반포기로 발달하였다. 또한, Differential labelling 기법을 이용하여 Total과 ICM(inner cell mass)의 세포수를 조사한 결과, 초자 동결 후 발달된 배반포의 Total과 ICM 세포수(63.2$\pm$16.9, 13.5$\pm$4.0)와 대조군 세포수(54.0$\pm$15.2, 12.3$\pm$4.6)간에는 각각 유의차가 인정되지 않았다. 이러한 결과는 동결로 인한 수정란의 발달율은 다소 낮았지만, 동결후 융해된 수정란은 정상적으로 배반포까지 발달함을 보여준다. 이러한 결과로 미루어 보아, 본 실험에 사용된 초자화 동결 방법은 1-세포기 생쥐 수정란을 성공적으로 동결시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

• 한국가축번식학회지
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• 제22권4호
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• pp.349-357
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• 1998

본 실험은 체외 생산된 한우 배반포기배의 생존능이 초자화동결 융해 후에도 유지될 수 있는지를 조사하고자 실시하였다. 한우 배반포기배는 2 단계로 초자화동결되었는데, EG20에 3분간 평형 그리고 EFS40에 노출한 후 L$N_2$에 초자화되기까지 30~45 초간 처리하였다. 체외에서의 생존능은 융해 후 24시간째의 re-expanded 와 48시간째의 hatched 발달율로 조사하였다. 그 결과는 다음과 같다. 12번의 반복실험으로부터 체외 수정 후 체외 배양 7일째에 52.5% 의 배반포기배가 생산되었다. 배의 생존에 동결액이 미치는 영향을 조사하였던 바, 대조군 (100.0, 87.0%) 과 비교하였을 때 동결액 노출군 (100.0, 73.8%) 에서 유의한 독성은 확인되지 않았다. 그러나, 배반포기배가 초자화동결되었을 때, 높은 생존능(86.2, 55.4%) 은 확인되었지만 그 결과는 노출군과 대조군에 비교하여 볼 때 유의하게 낮은 것이었다.(p＜0.05). 배 발달단계와 배양날짜가 초자화동결된 난자의 생존에 미치는 영향을 조사하였던 바, 배양날짜와 상관없이 빠르게 발달한 난자군에서 유의하게 높은 생존능이 있음을 알 수 있었다 (p＜ 0.05). 또한, 같은 발달단계라 하더라도, 배양 7일째 배의 (re-expanded: 75.0~87.5%, hatched: 21.4~66.7%) 생존능이 배양 8일째 배의 (re-expanded: 58.6~78.3%, hatched: 10.3~52.2%) 생존능보다 높다는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 결과에서 볼 때 체외에서 생산된 한우 배반포기배는 EFS40 동결액을 사용하는 간편 2 단계 초자화방법으로 성공적으로 동결되어질 수 있으며 특히 배양 7일과 8일째의 expanded 배반포기배와 early hatching 배반포기배에서 더욱 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

• 한국가축번식학회지
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• 제23권2호
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• pp.141-148
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• 1999

본 실험은 체외 생산된 소 완전탈출 배반포기배의 생존능이 초자화동결 융해 후에도 유지될 수 있는지를 조사하고자 실시하였다. 완전탈출 배반포기배는 체외 수정 후 체외배양 9일과 10일에 얻었으며, 직경을 기준으로 small(S-HBs: ø$\leq$300 $\mu\textrm{m}$)과 large(L-HBs: ø＞300 $\mu\textrm{m}$)로 구분하였다. 동결액은 35% ethylene glycoJ(EG), 18% ficoll, 0.3 M sucrose와 10% FBS가 첨가된 mDPBS로 만들어진 EFS35를 사용했다. 완전탈출 배반포기배는 2 단계로 초자화동결되었는데, 10% EG에 5분간 평형 그리고 EFS35에 노출한 후 L$N_2$에 초자화되기까지 30~45초간 처리하였다. 체외에서의 생존능은 융해 후 2, 16 시간째의 재 팽창으로 조사하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 체외 수정 후 8 일째에 얻어진 배반포기배 (40.8%) 를 24~48 시간 추가배양했던 바, 체외 수정 후 9일째와 10일째의 완전탈출 배반포기배의 발달율은 20.5%와 6.7%였다. 또한, 완전탈출 배반포기배의 총 세포수를 조사하였던 바, 배양 9일째의 완전탈출 배반포기배의 총세포수 (232.7$\pm$16) 가 배양 10 일째의 완전탈출 배반포기배 057.5$\pm$9.3) 보다 많게 나타났다. 2) 체외수정 후 체외 배양 9일째 생산된 L-HBs 의 생존에 동결액이 미치는 영향을 조사하였던 바, 동결군 (75.5%) 이 대조군 (100%) 과 노출군 (100%) 에 비해 낮은 생존능을 보였다. 3) 완전탈출 배반포기배를 직경 (L-HBs, S-HBs)과 배양일로 구분하여 초자화동결된 난자의 생존에 미치는 영향을 조사하였던 바, 9일에 얻어진 완전탈출 배반포기배 (75.5%, 63.6%)는, 10일에 얻어진 완전탈출 배반포기배 (64.3%, 60.7%)보다 약간 높은 생존능이 있음을 알 수 있었다. 4) 융해 후 체외배조건이 난자의 생존능에 미치는 영향을 조사하였던 바, 동결 융해된 완전탈출 배반포기배의 생존능은 공배양 (43.2%, 41.9%)보다 mCR1aa (10% FBS) 배양액 (79.3%, 62.5%)에서 유의하게 높게 나타나는 것을 확인하였다 (p＜0.05). 따라서, 이러한 결과에서 볼 때 소 완전탈출 배반포기배는 EFS35 동결액을 사용하여 성공적으로 초자화동결 후 보존될 수 있음을 확인하였다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제34권2호
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• pp.117-124
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• 2007

목 적: 본 연구는 생쥐 전핵시기 배아를 완만동결법과 유리화동결법으로 동결-융해 후 배아의 생존율과 성장률을 비교하고자 시행하였다. 연구방법: 과배란을 유도한 생쥐로부터 전핵시기 배아를 획득하여 10% SSS가 첨가된 HTF 배양액으로 약 1시간 동안 배양한 후 두 개의 전핵이 관찰되는 정상적인 형태의 배아만 선별하여 동결하였다. 동결방법으로는 1.5 M PROH에 0.1 M sucrose가 함유된 완만동결법과 40% ethylene glycol, 18% Ficoll, 0.5 M sucrose가 혼합된 EFS40 용액과 EM grid를 이용하여 이용한 유리화동결법을 실시하였다. 동결-융해 후 전핵시기 배아의 회수율, 생존을 및 부화 포배기로의 성장률과 부화율을 비교하였다. 결 과: 각각의 방법으로 동결-융해 후 24시간 동안 배양하였을 때 2-세포기까지의 성장률은 완만동결군이 59.1%이었고 유리화동결군이 77.0%로 두 군간에 유의한 차이를 보였고 (p<0.003), 48시간 동안의 배양에서도 완만동결군이 53.3%이고 유리동결군이 72.6%로 유의하게 유리화동결군에서 높은 수세포기까지의 성장률을 보였으며 (p<0.003), 72시간 배양하였을 때의 상실배로의 성장률 역시 완만동결군이 46.7%이고 유리화동결군이 67.3%로 유리화동결군에서 유의하게 높은 성장률을 보였다 (p<0.001). 융해 후 144시간 동안 배양하였을 때의 부화포배기로의 성장률은 완만동결군이 26.3%이고 유리화동결군이 43.4%로 유리화동결군에서 유의하게 높은 성장률을 보였다 (p<0.005). 결 론: 생쥐 전핵시기 배아의 동결보존에서 유리화동결법은 완만동결법 보다 시간이 단축되고 비싼 장비가 필요없어 경제적이고 간단했을 뿐 아니라 동결-응해 후 전반적으로 높은 생존율과 성장률을 나타내었다.

• 대한수의학회지
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• 제35권3호
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• pp.635-641
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• 1995

The purpose of this study was to investigate the effects of developmental stage and equilibration time on survival of rabbit embryos following freezing by vitrification. Adult New Zealand White female rabbits were superovulated with PMSG and hCG. The 8-cell stage embryos were collected from 40 to 45 hours after hCG injection by flushing oviducts with Dulbecco's phosphated buffered saline and in vitro cultured in TCM-199 containing 10% fetal calf serum(FCS). Each embryos developed in vitro to 16-cell, compact morula and blastocyst was cryopreserved and cultured following thawing to examine their developmental potential to expanded blastocyst stage in vitro. The frozen-thawed-cultured embryos were stained with Hoechst 33342, and their nuclei were counted using a fluorescence microscope. On the toxicity test of EFS solution as cryopreservation, the survival rates of 8-cell stage embryos was decreased in reverse to increasing of exposure time over 5 minutes. The post-thaw survival rates of embryos on equilibration times was significantly(P<0.05) higher for 2 min. than for 5 or 10 minutes. From morula to blastocyst of rabbit embryos was more suitable than 8-cell stage for cryopreservation by vitrification. The higher post-thaw survival rate of embryos can be achieved by keeping the cryoprotectant at $4^{\circ}C$ than at $20^{\circ}C$. The mean number of nuclei per embryo following freezing by vitrification and in vitro culture to expanded blastocyst at compacted morula and blastcyst was not significantly differ from fresh blastocyst.

• 한국가축번식학회지
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• 제23권4호
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• pp.281-291
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• 1999

본 실험은 체외 생산된 한우 배반포기배에 적합한 동결 / 융해 방법을 찾고자 실시하였다. 체외배양 7일째에 생산된 배반포기배는 동해제 EFS40(40% ethylene glycol, 18% ficoll, 0.3 M sucrose 그리고 10% FBS가 첨가된 m-DPBS)과 embryo container인 EM grid (V-G) 또는 straw(V-S)를 이용해서 초자화 동결하였다. 동결과 융해는 두 방법 모두 2 단계로 실시하였으며, 처리시간은 V-G 방법이 2 분과 3분, V-S 방법이 3.5분과 10분 각각 소요되었다. 체외 생존능 평가는 융해 후 24시간째의 재팽창율과 48 시간째의 부화율로 조사하였다. 본 실험에서 얻어진 결과는 다음과 같다. 팽창 배반포기배를 이용하여 동결액 노출과 동결과정의 냉해가 배의 생존에 미치는 영향을 조사하였던 바, 융해 후 24시간째, 동결액 노출군 (100.0%)의 결과는 대조군 (100.0%)과 차이가 없었으며, 두 동결군 (V-G: 87.8%, V-S: 77.8%)의 생존율과 비교해 볼 때 유의하게 높았다 (P＜0.00l). 그러나, 융해 후 48시간째 각 처리군의 부화율을 조사하였던 바, V-G 군 (67.8%)은 V-S 군 (53.3%)보다 유의하게 높게 나타났으며 (P＜0.05), 동결액 노출군 (73.3%)과도 유의한 차이를 나타내지 않았다. 또한, 배발달단계 (초기, 팽창, 부화초기 배반포)와 동결에 사용된 embryo container(EM grid, straw)가 체외 생존율에 미치는 영향을 동시에 비교하였던 바, embryo container 에 상관없이 빠르게 발달된 배반포기배가 느리게 발달하는 난자군보다 유의하게 높은 생존율을 나타내었다 (초기 : 57.1, 24.4%; 팽창 : 84.7, 60.6%; 부화초기 : 91.7, 80.0%)(P＜0.001). 특히, 팽창 배반포기배와 부화초기 배반포기배에서, 융해 후 48시간째, V-G군(67.8, 95.0%)의 부화율이 V-S군(53.0, 65.0%)보다 유의하게 높게 나타나 동결시 EM grid 의 유용성을 확인할 수 있었다 (P＜0.05, P＜0.001). 따라서, 한우 배반포기배는 EM grid를 사용하는 초자화 동결방법으로 간편하면서도 효율적이고 성공적으로 동결보존 할 수 있다는 것을 알았다.

• 한국발생생물학회:학술대회논문집
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• 한국발생생물학회 2003년도 제3회 국제심포지움 및 학술대회
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• pp.80-80
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• 2003

In cryopreserved rat embryos, survival rates obtained in vitro are not always consistent with the rates obtained in vivo. To determine the optimal conditions for in vivo development to term, rat embryos at the 4-cell, 8-cell and morula stages were vitrified in EFS40 by a 1-step method and transferred into oviducts or uterine horns of recipients at various times during pseudopregnancy. Vitrified and fresh 4-cell embryos only developed after transfer into oviducts of asynchronous recipients on Day -1 to -2 of synchrony, i.e., at a point in pseudopregnancy that was 1-2 days earlier than the embryos. However, although about half the vitrified embryos transferred into oviducts on Day -1 developed to term, only a minority of embryos transferred at later times did so, whether vitrified (10-34%) or fresh (24-33%), suggesting that this may not be the most suitable stage for cryopreservation. Very few 8-cell embryos, either vitrified or fresh, developed when transferred into oviducts on Day 0 to -0.5. However, when transferred into uterine horns, high proportions of vitrified 8-cell embryos (-63%) developed to term in reasonably synchronous recipients (Day 0 to -0.5) but not in more asynchronous ones (6%; Day-1). A majority of vitrified morulae also developed to term (52-68%) in a wider range of recipients (Day 0 to -1), the greatest success occurring with recipients on Day -0.5. Similar proportions of vitrified and fresh 4-cell embryos, 8-cell embryos and morulae developed to term when there was appropriate synchronization between embryo and recipient. Thus vitrification of preimplantation stage rat embryos does not appear to impair their developmental potential in vivo.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권1호
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• pp.35-42
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• 1996

본 실험은 체외수정에 의해 생산된 생쥐 배반포기배를 초자화 동결하였을 때 straw 제작방법 및 융해조건이 배반포기배의 생존성에 미치는 효과를 검토하고자 실시하였다. 융해시 각 straw내 동결보존액이 초자화 상태로 유지되는지를 확인하기 위하여 동결보존액 충전과 봉인방법이 다른 세 종류의 straw I, II, III가 제작되었는데, 이러한 모든 straw는 실온에 1~10초까지 노출된 후 $25^{\circ}C$ 수조에 침지되었다. 수정란은 20% ethylene glycol에 5분, EFS 40 용액에 1분간 노출된 후, straw내로 옮긴 다음 straw I과 II의 경우는 straw powder로, straw III는 straw powder와 열처리로 봉인하여 액체질소에 침지하여 다음과 같은 결과를 얻었다; 1) Straw I embryo column은 융해시 3~6초의 실온 노출을 제외한 대부분의 노출시간에서 불투명한 반초자화 상태로 변화되었다. 그러나 Straw II embryo column을 사용하였을 때 다소 개선되었으나 완전히 초자화 상태를 유지하지는 못하였다. 반면, Straw III embryo column의 경우는 융해시 완전한 초자화 상태를 유지할 수 있었다. 2) Straw III loading 방법을 사용하여 초자화 동결, 융해된 난자의 생존율은 Straw I loading 방법을 사용하였을 때에 비해 유의하게 높았으며(P<0.05), 표준오차 범위는 낮게 나타났다. 3) 초자화 동결보존된 난자를 실온에 3, 5, 10초간 노출한 후 $25^{\circ}C$ 수조내에 침지하여 융해하였을 때, 배양 24시간째 생존율은 72.7~87.1%이었고, 배양 48시간째 탈출배반포기배까지의 발달율은 34.0~48.4%이었으며, 융해시 각 처리간 유의차는 인정되지 않았다. 본 연구 결과, 초자화 동결 융해 후 높은 생존율 및 낮은 오차범위는 Straw III loading 방법과 double 봉인방법 및 적절한 2단계 융해법을 사용함으로서 얻을 수 있었다.