바이로이드는 매우 작은 RNA 분자로 구성되어 있으며, 외피 단백질이 없고 오로지 식물에만 감염되어 질병을 유발한다. 바이로이드 감염 질병을 예방하거나 진단하는 것은 상당히 어려운 일이며, 이는 병징이 초기에는 발견되지 않고 수확기에 접어들어서 발견되기 때문이다. 한편, 혈청학적인 방법은 식물 병원체를 검출하기 위해 주로 사용되었으나 바이로이드는 핵산인 RNA로만 구성되어 있기 때문에 이 방법으로 검출할 수가 없다. 때문에 바이로이드를 검출하기 위해 주로 사용되는 방법은 분자 생물학적인 방법으로, 초기에는 바이로이드의 분자적인 크기와 구조적 특징을 이용한 겔 전기 영동 방법이 주로 사용되었다. 그 후에는 역전사 반응과 중합효소 연쇄반응을 접목시킨 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 방법이 활용되었고, 그에 대한 효율적인 결과 확인을 위해 형광 물질을 도입한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-time RT-PCR)이 도입되었다. 그러나 그들은 온도를 변화시키기 위한 값비싼 기기와 전문적인 인력이 필요함으로 현장에서는 활용되기가 어렵다. 최근 개발된 고리 기반의 등온 증폭법(Loop-mediated isothermal amplification)의 경우, 온도의 변화가 필요 없어 비싼 온도 조절 기기가 필요하지 않다. 또한 매우 높은 증폭 효율을 지니며 반응 시간이 짧은 등의 여러 장점을 지니고 있기에 최근 현장 진단용 기술에 도입되고 있다. 이러한 배경으로, 이 총설에서는 바이로이드 유발 질병에 대하여 요약하고 그에 대한 검출 및 진단 방법에 대한 연구 동향에 대하여 기술하였다.
Hop stunt viroid(HSVd) is a plant pathogen which infect a number of hosts such as grapevine, Citrus and Prunus plants. Sequence variants of HSVd have been divided into three types(i. grapevine and hop, ii. citrus, iii. plum, peach, apricot and almond). Purified RNAs from plum trees were used for the synthesis of cDNA with reverse transcription and amplified by polymerase chain reaction. Cloned cDNAs were sequenced and two different consensus sequence variants were detected. A neighbor-joining analysis was carried out on the sequence variants together with 62 previously described variants of HSVd from hop, plum and other species. Sequence variants from plum trees cultivated in Korea were clustered in HSVd-plum subtype and not in HSVd-hop subtype which were two Korean isolates belongs. These relationship between sequence variants from plum and two Korean isolates in HSVd-hop type supports the other origin for hop stunt disease.
In the survey from 1992 to 2000, twenty-eight parasitic diseases were observed in major apple producing areas in Korea. The predominant apple diseases were white rot(Botryosphaeria dothidea), Marssonina blotch(Marssonina mali), Valsa canker(Valsa ceratosperma), Alternaria leaf spot(Alternaria mali), and bitter rot(Collectotrichum gloeosporioides and C. acutatum). Apple scab that reappeared in 1990 after disappearance for 15 years was disappeared again since 1997. A viroid disease(caused by apple scar skin viroid) was newly found in this survey. The five diseases, fire blight(Erwinia amylovora), black rot(Botryosphaeria obtusa), scab(Cladosporium carpophilum), Monochaetia twig blight(Monochaetia sp.), and brown leaf spot(Hendersonia mali), which had once described in 1928 but no further reports on their occurrence, were not found in this survey. However, blossom blight(Monilinia mali), brown rot(Monilinia fructigena), and pink rot(Trichothecium roseum), which did not occur on apple after mid 1970s, were found in this survey.
tRNA and 7SL RNA based antisense vehicles were prepared by inserting conserved anti-viral and anti-viroid domains. Anti-PVS coat protein leader sequence (ACPL) and antistructural antihairpin domain of PSTVd (AHII) were inserted in tRNA cassette; anti- zing finger domain of PVS, AHII and anti hop latent viroid ribozyme were inserted in 7SL RNA gene isolated from A. thaliana. These constructs were shown to be transcribed both, in in vitro and in in vivo conditions. However, it followed from our work that closely linked position of PoIII reference genes and PoIIII antisense genes within T-DNA lead to the impairment of RNA expression in transgenic plants. To assay in vivo transcription of antisense genes, hairy root potato cultures were established using h. tumefaciens A4-24 bearing both, Ri plasmid and PoIII-promoterless plant expression vectors with antisense RNA genes. Expression of antisense RNA in transgenic potato tissues was proven by specific RT-PCR reactions.
CSVd-infected chrysanthemum plants grown under $10^{\circ}C\;or\;15^{\circ}C$ growth chamber for 2 months resulted a higher dilution endpoint of template RNA for Reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) than those grown for 1 month: $10^{-4}(1.35{\times}10^{-2}ug/ml)$ for 1 month, and $10^{-3}(1.35{\times}10^{-1}ug/ml)$ for 2 months. Independent experiment, shoots cut from CSVd (Chrysanthemum stunt viroid)-in footed chrysanthemum plants grown under $10^{\circ}C\;or\;20^{\circ}C$ growth chamber for 2 months showed the same CSVd concentration as control($30^{\circ}C$) at 8 weeks after moving them to normal green-house condition($30^{\circ}C$). From those results, it was concluded that even though the concentration of CSVd was reduced in plants grown at low temperatures, when they were moved to normal glass-house temperature CSVd concentration increased to that of untreated plants in 8 weeks. This conclusion was supported by the rapid replication of CSVd in chrysanthemum after infection.
국내외적으로 ACLSV, ASGV, ApMV, ASSVd와 같은 바이러스 및 바이로이드 병의 발생으로 사과 과실의 생산량 감소와 기형적인 외형 등 많은 문제점들이 보고되었다. 하지만 사과 바이러스의 감염에 대한 방제 대책은 거의 알려진 바가 없는 실정이다. 따라서 본 논문에서는 사과 신품종인 '단홍', '홍안', '새나라', '썸머드림'을 분양하기에 앞서 바이러스 무병묘를 생산하는 시스템을 확립하고자 하였다. $37^{\circ}C$가 유지되는 항온 항습장치에서 4주간 열처리를 하였으며 기내에서 경정 배양을 하였다. 열처리된 각각의 사과 신품종들은 바이러스 진단 프라이머를 통해 RT-PCR을 수행하여 바이러스 진단을 수행하였다. 결과적으로 '단홍'은 28%의 바이러스 무병묘를 확보할 수 있었으며 '홍안'은 16%, '새나라'와 '썸머드림'은 12%의 확률로 바이러스 무병 사과를 확보할 수 있었다. 본 연구결과는 열처리 및 경정배양을 통해 사과 신품종에서 바이러스 무병묘 생산 시스템 구축이 가능함을 보여주었다.
Apple (Malus domestica) is one of the most economically important fruits in Korea. But virus infection has decreased sustainable production of apple and caused the serious problems such as yield loss and poor fruit quality. Virus or viroid infection including Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), Apple stem pitting virus (ASPV), Apple stem grooving virus (ASGV), Apple mosaic virus (ApMV) and Apple scar skin viroid (ASSVd) has been also reported in Korea. In many cases, apple is infected with virus and viroid with no specific symptoms, the damage caused by the virus are unaware significantly. In our research, we tried to eliminate viruses in the rootstock for the disease-free seedlings of the apple dwarfing rootstock M.9 and M.26. The method of virus elimination was meristem culture, heat($37^{\circ}C$, 6weeks) treatment and chemistry($Ribavirin^{(R)}$) treatment. The analytical methods commonly used for the detection of virus is Enzyme-linked Immuno-Sorbent Assay(ELlSA) and Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction(RT-PCR). RT-PCR method was more 30% sensitive than ELISA method. Efficiency of method eliminate virus appeared meristem method > heat treatment > chemistry treatment. The higher acquisition rate of disease-free seedlings is 30~40% on meristem treatment. In meristem treatment, the apple dwarfing rootstock M.9 gained infection ratio of ACLSV, ASPV and ASGV were 45%, 60% and 50% respectively. In the apple dwarfing rootstock M.26, infection ratio of ACLSV, ASPV and ASGV were 40%, 55%, 55%, respectively. Based on our results, it was found that most effective method of disease-free seedlings apple dwarfing rootstocks was by meristem treatment than heat method and chemistry treatment.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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