Vibrio vulnificus cytolysin has been incriminated as one of the important virulence determinants in V. vulnificus infection. In the present study, the effects of Vibrio vulnificus cytolysin on platelets were examined. Vibrio vulnificus cytolysin induced platelet aggregation and increased intracellular calcium concentration ($[Ca^{2+}]_i$) of rat platelets. These effects were abolished in $Ca^{2+}-free$ buffer (2 mM EGTA). Cytolysin also potentiated ADP-and collagen-induced platelet aggregation. Lanthanum (2 mM) inhibited cytolysin-diduced platelet aggregation. However, another $Ca^{2+}$ channel blockers, verapamil ($20{\;}{\mu}M$) or mefenamic acid ($20{\;}{\mu}M$) did not block cytolysin-induced platelet aggregation. Osmotic protectants, sucrose (50 mM) and raffinose (50 nM) suppressed platelet aggregation by 35.9% and 63.4%, respectively. V. vulnificus cytolysin increased membrane conductances of platelet membranes. These results suggest that cytolysin-induced platelet aggregation is mediated via lanthanum sensitive-calcium influx which resulted from the pore formation by V. vulnificus cytolysin.
Cytolysin produced by Vibrio vulnificus ATCC 27562 was partially purified by sequential ammonium sulfate precipitation, gel filtration with Sephadex G-200, and ion exchange chromatography with DEAE-Sephadex. The partially purified cytolysin was inactivated by cholesterol. More than one molecule of the cytolysin was required to lyse a single erythrocyts. The antiserum against cytolysin enhanced the survival ratio of mice infected with low dose of V. vulnificus.
Vibrio vulnificus cytolysin caused platelet cytolysis and increased intracellular calcium concentration $([Ca^{2+}]_i)$ of rat platelets in a concentration-dependent manner. In the presence of V. vulnificus cytolysin (3 HU/ml), lactate dehydrogenase (LDH) activity was increased from $1.3{\pm}0.4%$ of control to $64.3{\pm}3.4%$ in platelet suspension buffer. In $Ca^{2+}-free$ platelet suspension buffer, however, V. vulnificus cytolysin did not induce $[Ca^{2+}]_i$ increase and LDH release. Addition of EGTA (2 mM) to suspension buffer after the initial $Ca^{2+}$ influx reversed $[Ca^{2+}]_i$ to the control level. However, a $Ca^{2+}$ channel blocker verapamil $(20\;{\mu}M)$ or mefenamic acid $(20\;{\mu}M)$ did not inhibit V. vulnificus cytolysin-induced $[Ca^{2+}]_i$ increase and LDH release. Divalent cations such as $Co^{2+},\;Cd^{2+}\;or\;Mn^{2+}$ (2 mM each) also did not alter V. vulnificus cytolysin-induced $[Ca^{2+}]_i$ increase and LDH release. V. vulnificus cytolysin (3 HU/ml)-induced calcium influx was completely blocked by lanthanum (2 mM). Lanthanum (2 mM) also completely blocked V. vulnificus cytolysin (3 HU/ml)-induced LDH release. Osmotic protectants such as, raffinose, sucrose or PEG600 (50 mM each) did not inhibit the lytic activity of V. vulnificus cytolysin. In conclusion, lanthanum sensitive $Ca^{2+}$ influx plays a significant role in Vibrio vulnificus cytolysin-induced platelet cytolysis and thrombocytopenia in V. vulnificus infection.
Park, Kwang-Hyun;Rho, In-Whan;Park, Byung-Hyun;Kim, Jong-Suk;Kim, Hyung-Rho
BMB Reports
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v.32
no.3
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pp.273-278
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1999
Cytolysin produced by Vibrio vulnificus has been known to be lethal to mice by increasing vascular permeability and neutrophil sequestration in the lung. In the present study, a cytotoxic mechanism of V. vulnificus cytolysin on the neutrophil was investigated. Cytolysin rapidly bound to neutrophils and induced cell death, as determined by the trypan blue exclusion test. V. vulnificus cytolysin caused the depletion of cellular ATP without the release of ATP or lactate dehydrogenase. Formation of transmembrane pores was evidenced by the rapid efflux of potassium and 2-deoxy-D-[$^3H$]glucose from cytolysin-treated neutrophils. It was further confirmed by the rapid flow of monovalent ions in the patch clamp of cytolysin-treated neutrophil membrane. The pore formation was accompanied by the oligomerization of cytolysin monomers on the neutrophil membrane as demonstrated by immunoblot, which exhibited a 210 kDa band corresponding to a tetramer of the native cytolysin of $M_r$ 51,000. These findings indicate that V. vulnificus cytolysin rapidly binds to the neutrophil membrane and oligomerizes to form small transmembrane pores, which induce the efflux of potassium and the depletion of cellular ATP leading to cell death without cytolysis.
Kim, Hyun-Chul;Chae, Soo-Wan;Park, Jin-Bong;Park, Kyu--Cho
Proceedings of the Korean Biophysical Society Conference
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1997.07a
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pp.34-34
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1997
Vibrio vulnificus is an estuarine bacterium that has been associated with septicemia and serious wound infection in person. Cytolysin has been incriminated as one of the important virulence determinants. Little is known about the target cell of Vibrio vulnificus cytolysin in the body. Recently, we observed cytolysin-induced blood coagulation in rat.(omitted)
Cytolysin produced by Vibrio vulnificus has been incriminated as one of the important virulence determinants in V. vulnificus infection. Ion selectivity of cytolysin-induced pores was examined in a CPAE cell, a cell line of pulmonary endothelial cell, using inside-out patch clamp techniques. In symmetrical NaCl concentration (140 mM), intracellular or extracellular application of cytolysin formed ion-permeable pores with a single channel conductance of $37.5{\pm}4.0$ pS. The pore currents were consistently maintained after washout of cytolysin. Replacement of $Na^+$ in bath solution with monovalent ions $(K^+,\;Cs^+\;or\;TEA^+)$ or with divalent ions $(Mg^{2+},\;Ca^{2+})$ did not affect the pore currents. When the NaCl concentration in bath solution was lowered from 140 to 60 and 20 mM, the reversal potential shifted from 0 to -11.8 and -28.2 mV, respectively. The relative permeability of the cytolysin pores to anions measured at $-40\;mV\;was\;Cl^-\;=\;NO_2^-\;{\geq}\;Br^-\;=\;I^-\;> \;SCN^-\;>\;acetate^-\;>\;isethionate^-\;>\;ascorbic acid^-\;>\;EDTA^{2-},$ in descending order. The cytolysin-induced pore current was blocked by $CI^-$ channel blockers or nucleotides. These results indicate that V. vulnificus cytolysin forms anion-selective pores in CPAE cells.
In order to identify Vibrio vulnificus in the Yellow Sea near Gunsan, Korea during the early and late summers, the efficiency of the real-time quantitative TaqMan PCR was compared to the efficiency of the conventional PCR and Biolog identification system^TM. Primers and a probe were designed from the hemolysin/cytolysin gene sequence of V. vulnificus strains. The number of positive detections by real-time quantitative TaqMan PCR, conventional PCR, and the Biolog identification system from seawater were 53 (36.8%), 36 (25%), and 10 strains (6.9%), respectively, among 144 samples collected from Yellow Sea near Gunsan, Korea. Thus, the detection method of the real-time quantitative TaqMan PCR assay was more effective in terms of accuracy than that of the conventional PCR and Biolog system. Therefore, our results showed that the real-time TaqMan probe and the primer set developed in this study can be applied successfully as a rapid screening tool for the detection of V. vulnificus.
Kim, Jong-Hyeon;Kim, Jong-Suk;Yoo, Wan-Hee;Hur, Hyeon
Journal of Food Hygiene and Safety
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v.21
no.4
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pp.213-217
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2006
The halophilic bacterium Vibrio vulnificus is known to be a foodborne pathogen that causes septicemia in human. V. vulnificus infection is characterized by the high fatality rates and the primary attack against a person who have underlying diseases such as liver cirrhosis. However, there is no effective treatment for V. vulnificus septicemia except for classical treatments such as antibiotics. Recently, it has been known that lipoprotein (LDL) plays a major role in the protection against infection and inflammation. Consequently in this paper we analyzed the effects of LDL on V. vulnificus septicemia. We purified V. vulnificus cytolysin, a major virulent factor of V. vulnificus infection and measured inhibitory effects of mouse serum, cholesterol, and LDL on its hemolytic activity. Next experiments were performed to investigate whether LDL has a protective role against septicemia induced by V. vulnificus in mice. Intraperitoneal injection of LDL (1mg as protein) into mice 3hr before V. vulnificus $(1\times10^6\;CFU)$ injection, and V. vulnificus -induced lethality was determined. For the determination the relationship between LDL or cholesterol and prognosis, we determined serum levels of cholesterol and lipoprotein from V. vulnificus septicemia patients (n=15) who had visited the Chonbuk National University Hospital in Chonju. V. vulnificus cytolysin -induced hemolysis of mice erythrocytes was completely inhibited by serum, cholesterol, and low-density lipoprotein. V. vulnificus- induced lethality of mice injected with LDL showed only 40% compared to 100% of control. In survival groups (n=4) of V. vulnificus septicemia patients (n=15), their serum LDL and cholesterol revealed normal levels ($153.3{\pm}40.7,\;LDL;\;190.8{\pm}16.3$, Total cholesterol). However, in death groups (n=11) showed very low levels ($35.6{\pm}13.9,\;LDL;\;59.2{\pm}15.1$, Total cholesterol). Our study indicates that cholesterol and LDL are a prognosis indicator of V. vulnificus septicemia as well as an inhibitor of virulent action of V. vulnificus cytolysin. We suggested that the serum levels of cholesterol or LDL would be major index in the treatment and prevention of V. vulnificus septicemia.
Kim, Shin Moo;Song, Kye Min;Kim, Seung A;Choi, Su Youn;Im, Hyo Bin;Seong, Chi Nam
Korean Journal of Clinical Laboratory Science
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v.36
no.2
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pp.69-75
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2004
Vibrio vulnificus is a halophilic bacterium frequently involved in human infection of seafood-associated primary septicemia and primary wound infection, mostly in men with over 40-years of age with underlying liver disease. The primary septicemia, which is the most common form of V. vulnificus infection in Korea, is defined as a systemic illness presenting fever or hypotension with recovery of V. vulnificus from blood or tissue without the apparent primary focus of infection. V. vulnificus typically do not produce acid from sucrose, but a case of primary septisemia was found in a patient at Chonnam K hospital in 1993 from whose blood a sucrose-fermenting strain was isolated. The patient was a 62-year-old man, heavy drinker, with underlying liver disease. He consumed a raw seafood dish two days before onset of the present illness. His symptoms were tenderness and swelling on the right foot. He rapidly developed septicemia, resulting in sudden death. V. vulnificus was isolated from the venous blood culture of the patient. On subculture, the isolate formed yellow colonies on TCBS and produced acid from sucrose. Because of these characteristics, species identification was not achieved by the API 20E and was delayed. Other characteristics of the isolate were identical to those of typical V. vulnificus. The isolate was common serotype O4A and possession of V. vulnificus-specific cytolysin gene was detected by PCR. The isolate was susceptible to all the antimicrobial agents tested including tetracycline, but was intermediate to colistin. In conclusion, it is important that microbiologists be aware of the presence of sucrose-positive V. vulnificus when he or she identifies gram-negative bacilli, which is isolated from the blood of patients with a recent history of raw seafood dish consumption.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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