• Journal of Nutrition and Health
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• 제47권1호
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• pp.1-11
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• 2014

널리 음용되고 있는 녹차의 EGCG과 우리나라 국민의 상당수가 복용하고 있는 건강기능성 식품 성분인 글루코사민은 이전의 연구들을 통해서 지방세포의 분화를 억제하는데 효과가 있다고 보고되어왔다. 이 두 물질의 병합처리로 기대되어지는 지방세포에서의 adipogenesis 및 지방축적감소에 대한 상승효과는 검증된 바 없으며, 효과에 대한 cell cycle 차원에서의 접근은 없었다. 본 연구 결과에서 EGCG와 Glucosamine 6-phosphate는 adipogenesis 전사인자인 $PPAR{\gamma}$, $C/EBP{\alpha}$, SREBP1에 대한 직접적인 발현 억제 뿐아니라, $PPAR{\gamma}$, $C/EBP{\alpha}$, SREBP1와 매개된 FAS, ACSL1, LPL과 같은 adipogenic target 유전자의 발현 감소를 통하여 지방세포의 분화와 지방세포 내 지방축적을 감소시키는 효과를 나타냈다. 그리고 HSL과 perilipin의 발현조절을 통해 부분적인 lipolytic effet도 나타냈다. 또한 지방세포의 분화가 개시되는데 있어 중요한 DNA의 remodeling 과정인 mitotic clonal expansion (MCE) 과정 중 G0/G1 phase 단계에서 cell cycle 정지 유도와 그로인한 S phase 및 G2/M phase로 세포주기이행의 방해를 통해 지방세포가 분화되는 것은 억제하였다. 이러한 효과들은 EGCG 농도가 높아질수록, 그리고 EGCG를 단독으로 처리한경우보다 Glucosamine 6-phosphate와 병합하였을 때 효과적이었다. 따라서 EGCG 단독처리 및 glucosamine 6-phosphate와의 병합처리는 지방세포에서 adipogenesis와 adipogenic관련 유전자들의 발현 억제 및 MCE 단계의 cell cycle arrest를 통해 지방세포의 분화를 억제하고 지방축적을 감소시켜 항비만 효과를 나타냈으며, 이러한 효과는 두 성분의 병합처리에서 조금 더 효과적이었다고 할 수 있다. 비록 두 성분의 병합처리가 기대했던 만큼은 아니었으나 항비만 효과에 대한 상승효과가 있다고 볼 수 있다.

• 한국작물학회지
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• 제60권4호
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• pp.448-457
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• 2015

다양한 가공제품을 개발하여 쌀 소비를 확대시키기 위하여 가공용도에 적합한 물성을 지닌 벼 품종을 개발하려는 노력이 계속되고 있는데, 특히 중간찰은 현미밥, 떡, 과자, 식혜, 술 등 다양한 가공식품 소재로 이용성이 높다. 국립식량과학원에서는 조생, 다수성 품종인 '남일'에 돌연변이원으로 아지드화나트륨을 처리하여 다수의 배유변이 계통을 확보한바 있다. 본 연구는 중간찰 특성을 발현하는 'Namil(SA)-dull1'의 작물학적 특성을 평가하고 아밀로스 함량을 지배하는 주동유전자위의 염색체상 위치를 규명하고자 수행되었다. 주요 결과는 아래와 같다. 1. 생산력 시험을 통해 'Namil(SA)-dull1'의 주요 작물학적 특성을 평가한 결과, 원품종인 '남일'에 비해 출수는 약 9일정도 늦은 중생종으로 간장과 수당립수가 유의하게 증가하였으나, 수수와 천립중은 다소 감소하여 수량성은 다소 낮게 평가되었다. 2. 'Namil(SA)-dull1'과 통일형인 '밀양23호'와의 교잡에서 유래한 94개 $F_2$ 개체로 구성된 유전분석집단에 대해 53개 SSR 마커의 유전자형을 검정하고, $F_{2:3}$ 종자의 아밀로스 함량을 조사하여 연관성분석(association analysis)를 수행한 결과 목표 유전자위는 염색체 6번 하단으로 추정되었다. 3. 염색체 6번 하단부위의 분자표지 밀도를 높이기 위하여 8개 SSR 마커를 추가로 배치하여 연관성분석을 수행한 결과, 염색체 6번 하단을 표지하는 RM7555의 유전자형변이가 유전분석집단의 아밀로스 함량변이의 81%를 설명한다는 것을 확인하였다. 4. 유전자지도 작성에 사용된 분자표지들이 표지하는 염색체 부위를 벼 전장유전체정보(rice pseudomolecule)에서 확인한 결과, 중간찰 특성을 지배하는 유전자위를 염색체 6번 28.95~29.89 Mbp 영역에 해당하는 약 0.94 Mbp 절편으로 제한할 수 있었으며, 향후 추가분리집단을 이용하여 목표 유전자를 동정하고 다양한 아밀로스 함량을 지니는 벼 신품종 육성의 효율성을 제고할 수 있는 초정밀분자표지를 개발할 계획이다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제52권5호
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• pp.485-496
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• 2002

연구배경 : Nuclear factor ${\kappa}B$ (NF-${\kappa}B$)는 면역기능, 급성기 반응, 세포주기 조절 등 다양한 세포활동을 조절하는 전사인자로서 외부 자극에 의해 세포질에 존재하던 NF-${\kappa}B$가 핵 속으로 이동되어 여러 유전자의 ${\kappa}B$ element에 결합하여 그 유전자의 전사를 가져온다. 최근 들어 암의 발생과 증식 및 전이에 있어 NF-${\kappa}B$의 역할이 주목받고 있다. 즉, 여러 종류의 암세포에서 NF-${\kappa}B$의 과발현 및 지속적인 활성화가 알려져 NF-${\kappa}B$와 암의 발생 및 증식과의 관련성이 제시되고 있고, NF-${\kappa}B$의 항 아포프토시스 기능은 암세포의 생존에서 중요한 역할을 하는 것으로 이해되고 있다. 또한 ICAM-l, VCAM-l 등 세포 부착물질의 발현에 영향을 끼쳐 암 전이와의 관련성도 제시되고 있다. 폐암에서 NF-${\kappa}B$의 역할에 관한 연구는 많지 않은 상태로 폐암 조직 및 폐암 세포주에서 p50과 c-Rel의 과발현이 보고된 바 있다. 그러나 NF-${\kappa}B$의 과발현이 NF-${\kappa}B$의 활성화를 의미하는 것은 아니며 현재까지 폐암 세포에서 NF-${\kappa}B$의 활성화 유무에 관한 연구는 없는 실정이다. 방 법 : 본 연구에서는 정상 기관지 세포주와 폐암 세포주에서 기저 상태와 외부 자극에 의한 NF-${\kappa}B$의 활성화를 비교하여 폐암 세포에서 NF-${\kappa}B$의 활성도를 평가하였다. 정상 기관지 상피세포로는 BEAS-2B 세포주를 사용하였고 폐암 세포주로는 A549, NCI-H358, NCI-H441, NCI-H522, NCI-H2009, NCI-H460, NCI-H1229, NCI-H1703, NCI-H157, NCI-H187, NCI-H417, NCI-H526 등 12종을 실험에 사용하였다. NF-${\kappa}B$의 활성화는 p65와 p50의 핵내 발현과 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)를 이용한 NF-${\kappa}B$ DNA binding activity로 평가하였다. 결 과 : NCI-H358과 NCI-H460 세포를 제외한 모든 폐암 세포주와 BEAS-2B 세포의 기저상태에서 핵 단백질내에 p65와 p50의 발현이 관찰되었다. TNF-$\alpha$로 자극하고 30분이 경과한 후에는 핵 내 p65와 p50의 발현이 증가하였다. NCI-H358과 NCI-H460 세포에서는 기저 상태와 TNF-${\alpha}$ 자극 시 핵 단백질 내의 p65의 발현이 관찰되지 않았고 TNF-${\alpha}$ 자극했을 때에도 p65의 발현은 증가하지 않았다. 그러나 이 두 세포주에서는 TNF-${\alpha}$로 자극 시 p50보다 분자량이 작은 두 종의 단백질의 발현이 증가되어 p50의 변형된 형태로 생각되었다. 기저 상태에서의 NF-${\kappa}B$의 DNA 결합능은 실험에 사용한 모든 세포주에서 거의 관찰되지 않았고 TNF-${\alpha}$ 자극 시 유의하게 증가하였다. TNF-${\alpha}$ 자극으로 활성화된 NF-${\kappa}B$ complex는 NCI-H358 과 NCI-H460을 제외한 모든 세포주에서는 p50/p65 heterodimer로 확인되었고 NCI-H358과 NCI-H460에서는 변형된 p50/p50 homodimer가 활성화되었다. 결 론 : 이상의 결과로 일부 폐암 세포주에서 외부 자극으로 활성화된 NF-${\kappa}B$ complex의 구성에 차이를 보였지만 전체적으로는 정상 기관지 세포주와 비교해 폐암 세포해서 NF-${\kappa}B$ 활성화에 있어 큰 차이가 없었다.

• 대한치과교정학회지
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• 제27권2호
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• pp.335-347
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• 1997

교정치료시 치아이동은 치주인대세포를 매개로 골조직의 개조가 일어나는 과정으로서 골조직의 성장과 개조는 조골세포, 파골세포 및 그 전구세포의 증식, 분화 및 활성에 영향을 미치는 여러가지 전신적 인자와 국소적 인자에 의하여 조절되고 있다. 1.25-Dihydroxyvitamin $D_3$는 vitamin $D_3$의 대사물로서 경조직에 있어서 칼슘과 인산의 이동에 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려져 있으나 치주인대에 대한 1,25-Dihydroxyvitamin $D_3$의 생물학적 기능은 잘 알려져 있지 않다. 1.25-Dihydroxyvitamin $D_3$가 치주인대세포의 활성에 미치는 영향을 관찰하고자 10, 25, 50, 100ng/ml농도의 1,25 Dihydroxyvitamin $D_3$를 배양 치주인대세포에 첨가하여 배양 1, 2, 3일 후 M.T.T. 방법으로 세포의 활성을 관찰하였으며, 백서의 실험적 치아이동시 치주인대 내에 1,25-Dihydroxyvitamin $D_3$를 투여하여 12, 24, 36, 48, 72시간 및 7일 후의 조직 변화 소견을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 10ng, 25ng/ml 농도의 1,25-Dihydroxyvitamin $D_3$를 치주인대세포에 가한 후 배양 1, 2, 3일째의 실험군 활성은 대조군과 차이가 없었다. 2. 50ng/ml 농도의 1,25-Dihydroxyvitamin $D_3$를 치주인대세포에 가한 후 배양 3일째의 활성은 대조군에 비하여 유의하게 증가되었으며 100ng/ml농도에서는 배양 2, 3일째에 유의하게 많았다. 3. 백서에 교정력을 가한 후 인장측에서의 골아세포 활성, 치주인대섬유의 파열, 모세혈관 증식은 투여후 7일까지 1.25-Dihydroxyvitamin $D_3$ 투여측과 대조측 간에 차이가 없었다. 4. 교정력을 가한 후 36시간부터 1,25-Dihydroxyvitamin $D_3$를 투여한 압박측의 파골세포 활성 및 치조골 흡수량이 증가하였다. 이상과 같은 결과로, 50-100ng/ml 농도에서 1,25-Dihydroxyvitamin $D_3$의 농도와 배양 기간에 비례하여 치주인대세포의 활성이 증가하였으며 1,25-Dihydroxyvitarnin $D_3$가 투여 36시간부터 파골세포의 활성과 그에 따른 치조골 흡수량 증가에 영향을 미쳤다고 사료된다.

• Maxillofacial Plastic and Reconstructive Surgery
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• 제32권3호
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• pp.218-228
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• 2010

발암물질로 알려진 Hydroquinone (HQ)은 치과용 합성수지를 구성하는 중요한 성분으로서 지금까지 치과용 재료영역에서 널리 사용되고 있으며 구강 내에서 HQ의 유출이 일어나는 것으로 확인 되었다. 따라서 구강암의 기원이 되는 인체상피세포의 발암화에 HQ가 미치는 영향을 평가하였다. HQ에 의한 인체세포 독성을 평가하기위해 LDH assay를 실시하고 세포 독성이 높지 않은 용량을 실험 용량으로 설정하였다. 인체 세포의 발암화를 평가하기 위해 세포 발암화 지표로서 cell saturation density, soft-agar colony formation 및 cell aggregation의 분석을 사용한 결과 고용량인 50 ${\mu}M$을 제외한 모든 용량에서 발암화 지표의 변화를 나타내지 않아 HQ의 발암력은 매우 낮은 것으로 추정된다. 그러나 발암촉진제인 TPA와 함께 투여 시 발암력의 증가를 보여 주변 환경의 여건에 따라 발암력이 증가할 수 있음을 입증하였다. HQ를 노출 후 세포사멸화를 측정하기 위해 DNA fragmentation변화를 분석한 결과 10 ${\mu}M$부터 50 ${\mu}M$까지 노출 시간 의존형의 증가를 나타내었으며 50 ${\mu}M$과 같은 고용량 농도에서는 노출시간 의존적 세포사멸 효과를 보였다. 따라서 세포 발암화를 일으킨 용량에서 세포사멸도 함께 일어나 HQ에 의한 발암화에 세포사멸이 관여함을 보였다. HQ는 ROS를 생성하였으며 Trolox, NAC와 같은 항산화물에 의한 ROS의 차단 효과와 BSO와 같은 GSH 고갈 유발 물질에 따른 ROS의 급격한 증가는 HQ가 인체세포에서 ROS를 효율적으로 생성함을 입증하는 결과이다. 세포간의 신호전달기작 조절에 중요한 역할을 하는 효소인 protein kinase C (PKC)를 immunoblot으로 분석한 결과 PKC-${\alpha}$의 활성이 증가 된 반면 PKC-${\beta}II$의 영향은 나타나지 않았다. 따라서 특정 이성질체에 대한 특이적인 효소반응이 발암화에 관여할 것으로 추정된다. 본 연구결과 치과용 합성수지 구성성분인 HQ 유출에 따른 인체상피세포의 발암성은 매우 낮은 것으로 추정되나 발암촉진제 등과의 상호작용에 의한 발암성 증가는 HQ의 구강암 발생 평가에 고려되어야 할 사항이다. 따라서 본 연구는 구강암의 예방을 위한 과학적인 접근 방법 및 기반 자료를 제시하였고 치과용 합성수지사용의 적정성에 대한 과학적인 판단을 할 수 있는 근거를 제공 하였다. 또한 본 연구 결과는 새로운 치과용 합성수지 개발의 필요성 및 개선방향을 제시 할 수 있는 근거로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국임상수의학회지
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• 제28권2호
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• pp.204-210
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• 2011

국내 독일 셰퍼드로부터 에를리히아증과 라임병에 대한 항체가 조사를 위하여 효소면역측정법을 시용하였으며, 중합효소연쇄반응을 이용하여 진드기매개성 병원체를 조사하였다. 2005년 10월부터 2006년 9월까지 국내 5개 지방으로부터 291마리 독일 셰퍼드를 선정하였다. 개 에를리히아 항체 조사를 위한 ELISA (Snap$^{(R)}$ 3Dx$^{(R)}$ test kit, IDEXX) 검사결과 전국적으로 7.56%(22마리)의 에를리히아 양성 항체 보균개와 1.72%(5마리)의 보렐리아 양성 항체 보균개로 조사되었다. 이 중 2마리에서는 두 가지 병원체 모두에 대한 양성 항체가 검출되었다. 에를리히아에 대한 양성항체를 지방별로 보면 경기도는 1.28%(78마리 중 1마리), 강원도는 12.64%(87마리 중 11마리), 충청도는 9.76%(41마리 중 4마리), 경상도는 8.93%(56마리 중 5마리), 전라도는 3.45%(56마리 중 5마리)로 조사되었다. Ehrlichia chaffeensis 유전자를 검출한 결과 전국 평균이 3.09%(291 마리 중 9마리), 강원도는 2.41%(291 마리 중 7마리) 그리고 충청도는 0.69%(291마리중 2마리)로 조사되었다. 중합효소연쇄반응으로 증폭된 유전자(SNU-EC3과 SNU-EC5)에 대한 유전자염기서열분석결과 한국(Haemaphysalis longicornis 진드기)과 중국 그리고 Arkansas 분리주인 E. chaffeensis와 매우 유사하였다. 이 연구의 결과 국내에서 사육되는 독일셰퍼드에서 에를리히아증의 병원체와 라임병에 대한 항체가 검출된 것으로 볼 때 임상 진단에 있어서 진드기매개전염병에 대한 중요성을 인식해야 할 것으로 판단된다. 따라서 혈소판감소증이나 백혈구감소증이 있는 경우 그리고 봄부터 가을까지 야외활동을 한 경력이 있는 환자에 대한 감별진단 항목에 반드시 포함시켜야 할 것을 제안한다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제20권2호
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• pp.169-176
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• 2005

수정란의 성 판별은 유전적으로 우수한 유전형질을 보유하고 있는 소의 수정란을 성 판별하므로서 희망하는 성의 송아지를 생산할 수 있으며, 부가가치가 높은 수정란을 확보할 수 있는 기술이다. 수정란의 손상을 최소화하면서 할구를 biopsy하는 기술을 개발하고, 간단하고 빠른 시간에 성 판별이 가능한 Loop-mediated isothermal amplification방법으로 수정란을 성 판별을 실시한 결과는 다음과 같다. 1. 한우 체내 수정란의 성비는 암컷이 $56.5\%$, 수컷이 $43.5\%$였고, 체외 수정란은 암컷이 $49.2\%$, 수컷이 $33.9\%$였다. 그리고, 젖소 체외 수정란의 성비는 암컷이 $29.2\%$, 수컷이 $70.8\%$를 나타내어 한우 체내 및 체외 수정란보다 젖소 체외수정란의 수컷비율이 유의적으로 높게 나타내었다(p<0.05). 또한, 한우 체외 수정란에서 성 판별이 불가능한 것이 $16.9\%$를 나타내어 한우 체내 수정란 및 젖소 체외 수정란과는 유의적인 차이를 나타내었다.(P<0.05). 2. Biopsy한 체내 수정란의 체외 발달율은 $100\%$였으나 체외 수정란에서는 정상적으로 발달하지 못하고 퇴화된 수정란이 $13.2\%$로 체내 수정란보다 유의적으로 높은 결과를 나타내었다.(P<0.05). 3. Punching 방법으로 수정란의 biopsy 후 정상적으로 발달하지 못하고 퇴화된 수정란은 체내 및 체외 수정란에서는 없었으나 biopsy 방법으로 biopsy한 수정란은 체내 및 체외 수정란에서 각각 $16.7\%$ 및 $22.6\%$를 나타내어 Punching 방법보다 유의적으로 높은 결과를 나타내었다(P<0.05). 이상의 결과로 보아 한우 체내 수정란은 LAMP방법을 이용하여 간단하고 신속하게 성 판별이 가능하며, 수정란의 biopsy는 punching 방법이 수정란에 손상을 적게 주는 것으로 사료된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제45권4호
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• pp.714-722
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• 1998

연구배경: Rifampicin은 항결핵 단기요법의 근간이 되는 약제로 rifampicin 내성용 다제내성의 지표이기도 하다. rpoB유전자는 rifampicin이 결합하여 약리작용을 나타내는 RNA polymerase의 $\beta$-subunit을 coding하는 유전자이며 rifampicin내성 결핵균의 약 96%에서 돌연변이가 관찰된다. 그러므로 rifampicin내성결핵을 빠르게 진단할 수 있는 유용한 방법을 확인하기 위하여 PCR-line probe법과 PCR-SSCP법을 이용하여 다음의 연구를 시행하였다. 방 법: 대한 결핵연구원의 약제감수성검사상 rifampicin 내성인 결핵균주 33예와 감수성인 결핵균주 12예를 대상으로 하였다. 각각 배양균 집락에서 DNA를 분리한 후, PCR-line probe법과 PCR-SSCP법을 이용하여 rifampicin 내성 여부를 단일맹검적으로 검사하였고, 이를 약제감수성검사 결과와 비교하였다. 결 과: PCR-line probe법으로는 내성균주 33예중 27예(81.8%)에서 rpoB 유전자의 돌연변이를 확인할 수 있었고, 감수성균주 12예는 모두 rpoB 유전자의 돌연변이는 없었다. PCR-SSCP 법으로는 내성균주 33예중 23예(69.7%)에서 rpoB 유전자의 돌연변이를 확인할 수 있었고, 감수성균주 12예는 모두 rpoB 유전자의 돌연변이는 없었다. Rifampicin내성균주에서 rpoB 유전자 돌연변이 검출율의 PCR-line probe 법과 PCR-SSCP법간의 차이는 없었다 (p=0.25). 결 론: PCR-line probe법은 PCR-SSCP법과 더불어 rifampicin 내성을 조기에 진단할 수 있는 좋은 방법으로 사료되며, 전통적인 약제감수성검사 결과를 기다릴 수 없는 국한된 환자에게 유용한 진단법으로 생각된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제63권2호
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• pp.128-138
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• 2007

연구배경: INH 내성은 katG 와 inhA(ORF와 promoter)의 변이에 의한 것으로 알려져 있다. 유전자 변이는 지역적으로 종류와 빈도가 다르게 나타날 수 있는데 기존 국내의 연구보고들은 흔하다고 알려진 katG의 463 코돈만을 추적한 것들이었다. 따라서 본 연구는 국내에서 분리된 INH 내성균들의 두 유전자에서 나타날 수 있는 변이의 종류와 빈도를 확인하고자 하였다. 연구방법: 대한결핵협회 결핵연구원에서 MDR-TB로 판명된 INH 내성 결핵균 29주로부터 bead beater-phenol법으로 DNA를 추출하여 katG(2,223 bp), inhA ORF(-77~897, 975 bp) 및 inhA promoter(-168~80, 248 bp) 염기서열 결정 및 분석은 ABI PRISM 3730 XL Analyzer 및 MegAlign package를 사용하였다. 결과: 모든 균주들은 분석 표적으로 사용한 세 유전자 부위 중에서 적어도 한 개 이상의 유전자 부위에 변이가 있었다. INH 내성균은 거의 대부분(>93%) katG의 변이를 갖고 inhA 유전자 변이만 있는 경우는 드물어 INH 내성을 결정하는 중요한 요인은 katG의 변이 인 것을 확인할 수 있었다. katG 부위에서 Arg463Leu 변이와 Ser315Thr 변이가 높은 빈도(62.1% 및 55.2%)로 발견되었고, katG 완전결실과 inhA promoter-15($C{\rightarrow}T$) 변이도 일정한 빈도로 나타남을 볼 수 있었다. 그 외 inhA ORF 변이도 1주에서 1종류의 변이가 발견되었다. 결론: 기존 연구결과에서는 보고되지 않고 본 연구에서 처음으로 확인된 변이들도 14 종류나 있어서, INH 내성은 주로 katG 혹은 일부 inhA 특정 부위의 변이가 주도하지만 이들 외에도 다양한 변이가 존재한다는 것을 알 수 있었다. 이들 새로이 확인된 변이들은 염기서열 분석에 의한 INH 내성 여부 판단 시, 기존 알려진 변이 외에 보조 자료로 사용할 수 있을 것으로 생각한다.

• 대한생식의학회:학술대회논문집
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• 대한불임학회 2001년도 제2차 연수강좌
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• pp.195-205
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• 2001

태반 영양배엽 (trophoblast)은 포유동물의 발생과정 중 가장 먼저 분화되는 세포로서, 자궁환경내에서 배아가 착상, 발생, 및 분화하기 위해서 반드시 필요한 태반을 형성하는 색심적인 세포이다. 영양배엽 세포의 분화과정중의 결함은 배아의 사산이나 임신질환 등의 치명적 결과를 초래한다. 하지만, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 분자생물학적인 메카니즘은 아직 규명되지 않고 있다. 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 경로를 규경하기 위한 선결과제는 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 많은 유전자들이 밝혀져야만 한다. 본 연구팀은 최근에 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 두 종류의 새로운 유전자들을 찾았다. 한 종류는 homeobox를 보유하고 있는 조절 유전자 Psx이고, 다른 한 종류는 임신호르몬인 태반 프로락틴 라이크 단백질 유전자 PLP-C${\beta}$이다. 본 연구과제의 목표는 이들 유전자의 기능과 조절 메카니즘을 규명함으로써, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 조절경로를 밝히는 것이다. 이를 위하여 다음과 같은 일련의 연구를 수행할 것이다. 1) Psx 유전자가 분화된 영양배엽 세포에서만 발현케 하는 조절 메카니즘을 규명하기 위해 functional assays, in vitro footprinting, gel mobility shift assays, 생쥐형질전화, UV crosslinking, Southwestern blot 등의 방법을 통해 Psx 유전자의 cis-acting 요인과 trans-acting factor를 밝혀 분석한다. 2) 영양배엽 세포의 분화조절 경로를 규명하기 위해 random oligonuclotide library screening, DD-PCR, subtractive screening 등의 방법을 이용하여 Psx 유전자에 의해 조절되는 하부유전자를 밝힌다. 3) Psx 유전자를 knock-out시켜 영양배엽 세포가 발달 및 분화하는데 미치는 역할을 밝힌다. 4) Yeast two-hybrid screening방법을 이용하여 태반 프로락틴 유전자의 수용체를 찾아 이들의 신호전달 기전을 밝힌다. 제1차년 연구결과로서, mouse와 rat으로부터 각각 Psx 유전자의 genomic DNA를 클로닝하여, 유전자 구조를 비교한 결과, mouse Psx (mPsx2)는 4개의 exons으로 이루어져 있는 반면에, rat Psx (Psx3)는 3개의 exons으로 구성되어 있었다. 즉, rPsx3는 mPsx2의 exon1이 없었다. Notrhern blot과 in situ hybridization 분석에 의해 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 발현 조절되는 현상을 밝혔다. 실제로 mPsx2와 rPsx3의 5'-flanking지역을 클로닝하여 염기서열 분석 결과 전혀 homology를 찾을 수 없었다. 또한, 이들 각각 promoter의 activity를 luciferase reporter를 이용하여 조사한 결과 Rcho-1 trophoblast cells에서 각기 다른 activity를 보여 주는 것을 발견하였다. Psx 유전자의 transcription start sites는 Primer extension에 의해 밝혔다. 또한 Psx2 유전자를 knock-out 시키기 위해 targeting vector를 Osdupde1에 제작하였다. 본 과제를 시작할 때 새로운 프로락틴 유전자 하나를 클로닝하여 이 유전자를 PLP-I라고 이름을 붙였다. 이 후 이 유전자 (PLP-I)는 PLP-C${\beta}$라고 이름을 붙이게 되었다. Mouse PLP-C${\beta}$ 유전자의 counterpart를 rat에서 찾아 염기서열을 비교한 결과 mouse와 rat에서 PLP-C${\beta}$유전자의 homology는 약 79% (amino acid level)였다. 본 연구과정을 통해 또 하나의 새로운 PLP-C subfamily member를 mouse로부터 클로닝 하였고, 이 유전자를 PLP-C${\gamma}$라 하였다. PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$의 발현 유형은 Northern blot과 in 냐셔 hybridization 분석에 의해 태반의 제한된 spongitrophoblast와 trophoblast giant cells에서만 발현하는 것을 밝혔다. 놀랍게도 이들 두 새로운 유전자는 alternative splicing에 의해 두 종류의 isoform이 있음을 밝혔다. PLP family member 유전자로서 splicing에 의한 isoforms을 보여 주는 유전자로는 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 최초이다. 이들 isoform mRNAs의 발현 유형은 RT-PCR 방법을 이용하여 규명하였다. 또 하나의 새로운 발견은 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 독특한 유전자 구조를 갖고 있었다. 즉, PLP-C${\beta}$는 exon3의 alternative splicing에 의해 5개 혹은 6개의 exons을 갖는 two isoforms이 생긴다. 반면에 PLP-C${\gamma}$는 exon2가 alternative splcing이 되면서 7개의 exons을 갖거나 6개의 exons을 갖는 isoforms을 만든다. 그리고, PLP-C${\gamma}$의 promoter activity를 trophoblast Rcho-l${\gamma}$ 세포주를 이용하여 PLP-C${\gamma}$ 의 1.5 kb 5'-flanking 지역이 trophoblast-specific promoter activity를 갖고 있음을 밝혔다. PLP-C${\gamma}$ 유전자의 transcription start site는 Primer extension에 의해 밝혔다. 제 1차 년도의 연구결과를 토대로, 2차년에서는 다음단계의 연구를 수행하고자 한다. 즉, 1) mPsx2와 rPsx3의 promoter를 비교분석 함으로서 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 조절되는 메카니즘 규명, 2) Psx와 PLP-C 유전자의 promoter에 있는 cis-acting elements 탐색, 3) Psx2와 Psx3의 단백질을 이용하여 이들이 binding하는 target sequence 규명, 4) 제작한 Psx2 targeting vector를 이용하여 ES cells에서 Psx2 유전자 knock-out, 5) Psx 유전자를 과발현시키는 세포주를 만들고 Psx에 의해 조절되는 유전자 탐색, 6) 새로 밝히 PLP-C members 유전자들의 조절기전을 Rcho-1 세포주를 이용하여 여러 거지 성장인자와 다른 호르몬에 대한 반응을 탐색, 7) Psx와 PLP-C${\gamma}$ 유전자의 chromosomal mapping 등을 밝힐 것이다.