• 미생물학회지
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• 제24권1호
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• pp.24-31
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• 1986

Pseudomonas 속에 속하는 여러균주의 원형질체 생성을 위한 최적조건과 이들의 재생에 영향을 미치는 몇 가지 요인들을 조사하였다. Pseudomonas는 lysozyme ($100{\mu}g/ml$)과 10mM EDTA를 처리하였을 때 99.0%에서 99.9%까지 원형침체로 천환 되었으며, 이때 사용한 완충액의 최적 pH는 8.0이였고 효소처리는 상온에서 진탕하지 않고 처리하였을 때가 비교적 균주간에 차이가 없이 효과적으로 원형질체가 생성되었다. $MgCl_{2}$ 그러고 Streptomycin수용액이 윈형 질체의 안정성을 높였고, 원형질체의 생성에는 $Mg^+\;and\;Na^+$ 이온이 효과적으로 작용하였다. 원형질체의 재생은 Rich Regeneration Medium배지에 20mM $MgCl_{2}$를 첨가하였을 때 원형질체의 재생율이 28배까지 증가하였다. 원형질체의 생성과 그것을 희석하는데 사용한 완충액에 1% Bovine Serum Albumlne를 첨가한 경우 재생율이 10배 가까이 증가되었고, 또한 완충액에 1% BSA를 첨가하고 재생배지에 0.5% 제라틴을 첨가했을 때에는 14배까지 재생율이 증가되어다.

• 미생물학회지
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• 제31권4호
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• pp.318-325
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• 1993

아닐린 분해균주 Flavimonas oryzihabitans KU21 의 원형질체 생성, 재생, 그리고 융합 등의 최적 조건을 조사하였다. 세포를 37.deg.C 로 prewarming 시킨 0.2 M Tris-Hcl(pH8.0) 완총액으로 현탁시킹후 0.5% 이상 원형질체로 전환되었으며, 이때 효소처리는 37.deg.C 에서 진탕하지 않고 처리했을 때가 가장 효과적이었다. MgCl/sub 2/ 와 CaCl/sub 2/ 수용액은 원형질체의 안정성을 높였고 완층액에 0.8% BSA 를 첨가함으로써 상온에서 4시간 까지 원형질체의 생존력을 80% 까지 유지할 수 있었다. 원형질체의 재생은 overlaying 방법이 가장 효과적이어서 3.8% 의 재생을 보였다. Rich regeneration medium 에 20 mM CaCl/sub 2/ 를 첨가하였을 때 재생율이 약 3.5배 증가하였고 완충액에 0.8% BSA 를 첨가했을 때는 4.5배의 증가율을 나타내었다. 삼투안정제로 0.5 M sucrose 를 첨가한 rich regeneration medium 에서 F. oryzihabitans 의 원형질체는 top plating 하여 6시나 이후부터 재생되기 시작하여 11 시간까지 80% 의 재생이 이루어졌다. 융합원으로 40.deg. PEC6000 과 CaCl/sub 2/ 를 사용하여 F, oryzihabitans 의 종내 원형질체 융합을 유도하였을때 recombinants 의 생성율은 2.0 * 10/sup -5/-3.6 * oryzihabitans 의 종내 원형질체 융합을 유도하였을때 recombinants 의 셍성율은 2.0 * 10/sup -5/-3.6 * 10/sup -5/ 이었으며 recombinants 들은 여러 세대 후에도 분리되지 않고 안정하였다.

• 미생물학회지
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• 제24권3호
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• pp.228-235
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• 1986

Zymomonas mobilis의 spheroplast 형성과 새생조건의 새량과 초|소배시에서의 새생에 대해서 연구하였다. Tris-maleate buffer (pH 5~6), $Ca^{++}$ ions 그러고 EDTA등은 out야 membrane의 투과성 변화를 야기시 켰다 Zymommonas의 세포벽은 lysozyme, mutanolysin같은 세포벽 분해효소에 의해 분해가 되지 않은 것처럼 보였고 sphe-roplast 생성에 glycine 처리는 필수적이었다. 그러나 lysozyme 처리에 의해서 spheroplast 형성이 촉진되는 것을 확인하였다. 따라서 ly sozyme과 glycine을 함께 처리함으로서 spheroplasting배지에서의 처리시간을 4시간으로 단축 할 수 있었고 재생율이 7-10% 증가되었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제30권4호
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• pp.293-299
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• 1987

Bradyrhizobium japonicum ROKS 26 균주를 glycine및 Iysozyme을 처리하여 spheroplast를 형성시킨 후 Agrobacterium tumefaciens에서 분리한 Ti plasmid를 분리하여 형질전환 시키고 octopine 영양 요구성에 의하여 transformants를 분리하였다. 그 결과 Ti plasmid가 도입된 transformants의 형질전환율은 $1{\times}10^{-7}$ 정도 되었다. 얻어진 transformant의 plasmid를 조사한 결과 도입된 Ti plasmid 존재가 확인되었으며, 2차원 전기영동법으로 균체 단백질을 분석한 결과 수용세포인 Bredyrhizobium japonicum ROKS 26과 transformant간의 단백질 구성 차이도 화인되었다. 또한 transformant의 근류 형성력을 조사한 결과 본래의 근류의근류형성력을 가지고 있었으나, crown gall형성에 있어서는 Agrobacterium tumefaciens 15955에 의한 gall보다는 크기에 있어 차이가 있었다.

• 미생물학회지
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• 제26권4호
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• pp.298-304
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• 1988

Antibiotic resistance plasmids (RP4, pMG1, R679 and R91-5) were used as primary selective markers to detect the fusants in Pseudomonas spp. By using plasmid marker, clones containing both plasmids of parental strains were obtained as fusants by direct selection. The spheroplast fusion was occured not only between strains of interspecies, but also between strains of intergenus such as Pseudomonas and E. coli. The frequencies of fusant formation were variable from $2.8\times 10^{-1}$ to $6.0\times 10^{-4}$ -4/. In addition, chromosomal recombinants were formed among the clones with both parental plasmids in frequencies of 0.44-1.3%. The fusant formation frequency between interspecies of intraspecies was not different markedly, but stability of plasmids in fusants correlated with the phylogenic smilarity of the parental strains.

• 미생물학회지
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• 제36권4호
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• pp.259-266
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• 2000

아닐린분해능이 있는 Flavimonas oryzihabitans과 4-chlorobiphenyl (4-CBP)를 분해하는 Pseudomonas sp.를 원형질체 융합하여 아닐린과 4-CBP를 모두 분해하는 융합균주를 개발하고, 융합체의 특성을 조사하였다. F. oryzibhavitans는 융합체 선별표지 위애 NTG처리하여 chloramphenicol 내성 ($Cm^r$)을 유발하였다. Lysozyme-EDTA에 의한 각 모균주의 원형질체 생성율은 약 99%이었고, 원형질체의 재생율은 5.0~6.6%이었다. 원형질체는 40% PEG 6000을 사용하였을 때 효과적으로 융합이 이루어졌으며 융합율은 $3.16{\times}10^{-4} $이었다. 융합균인 F22의 DNA양는 모균주에 비해 약 2배 정도 증가 하였으며, 생화학적 특성은 모균주의 특성이 혼합하여 나타났다. F22는 5 mM 아닐린 최소배지에서는 모균주와 성장능과 분해능이 거의 비슷하였고, 10 mM 아닐린 최소배지에서는 1.5배 빠른 성장속도를 나타내었으나, 4-CBP 분해능은 모균주보다 약간 낮게 나타났다.

• 미생물학회지
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• 제25권3호
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• pp.198-204
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• 1987

P. pulida KU218R-3와 P. Putida KU42엠 원형질체 혼합액에 PEG 6000을 처리하여 biparental형과 recombinant형의 융합체를 얻었다. Pseudomonasd의 원형질체가 융합하는 형태는 TEM으로 관찰하였고, 원형질 융합체의 선별은 항생제 내성을 유전적 지표로 하여 간접적인 방법으로 선별하였다. Pseudomonas의 원형질체 융합에는 40% (w / v) PEG 6000을 상온에서 10분간 처리하는 것이 가장 효과적이었으나 PEG를 처리하지 않은 실험구에서도 융합체가 4%의 빈도로 생성되므로 PEG의 효과는 절대적인 것이 아니었다. 생성된 융합체의 대부분은 biparental clone이었고 (10.4%), recombinant clone의 생성빈도 는 너무 낮았디 (0.12%). 또한 biparental clone의 대부분은 further propagation 증에 모균주의 형태로 분리되었고, 이 과정 에서 late recombinant플 생성하였다. biparental clone에 t얀해 rE'combinant clonE은 여러 셔1대 후에도 안정하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제16권4호
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• pp.293-296
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• 1988

고온발효성인 Sacch. cerevisiae D-71과 내삼투압 성인 Zygosacch. rouxii SR-S의 원형질체를 조제하고 분리하여 그의 안정성을 검토하였다. Sacch. cerevisiae D-71의 원형질체는 0.8M KCI 과 1.0M sorbitol에서, Zygosacch. rouxii SR-S의 원형질체는 0.4M KCI과 mannitol에서 가장 안정하였고 두 효모의 원형질체들을 20Kc로 60초간 초음파 처리하였을 때 90% 이상이 파괴되었다. 또한 10000$\times$g로 10분간 처리하였을 때 Sacch. cerevisiae D-71의 원형질체는 93%, Zygosacch. rouxii SR-S의 원형질체는 84%의 안정성을 보였고 이들 원형질체들을 15W의 자외선 등으로 20cm에서 60분간 처리하였을 때 Sacch. cerevisiae의 원형질체는 99%, Zygosacch. rouxii SR-S의 원형질체는 55%가 파괴되었다.

• Journal of Yeungnam Medical Science
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• 제2권1호
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• pp.175-181
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• 1985

Polyethylene glycol(PEG) 처리에 의한 Agrobacterium tumefaciens spheroplast와 연초 엽육 protoplast의 상호작용을 연구하기 위하여, 효소적 방법으로 분리한 연초엽육 protoplast와 carbenicillin 및 lysozyme의 처리에 의해 제조된 Agrobacterium tumefaciens ATCC 15955 spheroplast를 섞어서 polyethylene glycol (PEG) 및 high pH-high $Ca^{2+}$ buffer를 처리한 후 시료를 취하여 전자현미경으로 관찰한 결과, spheroplast는 초기 단계에서 protoplast membrane에 부착하고, 시간이 경과함에 따라 endocytosis에 의해 protoplast의 세포질 내부로 도입된 다음, 점차로 그 형체(cell integrity)가 파괴되어지는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 관찰 결과로부터 spheroplast는 polyethylene glycol(PEG)에 의해 protoplast내부로 endocytosis되어짐을 알 수 있었다.

• 미생물학회지
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• 제29권2호
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• pp.117-122
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• 1991

In order to improve the removal ability of phosphate, Spheroplast fusions were performed among auxotrophic mutants of Aeromonas hydrophila isolated from waste water, named A13 and A14, Aci37 auxotrophic mutant of Acinetobactercalcoaceticus, and auxotrophic E. coli HR262/pCE27 carring pit gene. Eight fusants obtained from this experiment showed different biochemical characteristics. When the rate of phosphate uptake among fusants (F1-F8) was investigated in Phosphate Uptake Medium (PUM), F8 strain showed the highest rate for phosphate removal, 7 times as much as control after two hours incubation. The role of cations ($Mg^{++}$ ,$Ca^{++}$ , $K^{+}$ in phosphate uptade by F8 was also investigated in PUM without each salt. $K^{+}$ seemed to be crucial. Being compared with phosphate untake rate in PUM, that in PUM without $K^{+}$ was reduced 1.5 times. Therefore, by applying F8 strain and $K^{+}$ in practical environmental system, the increased efficiency in phosphate removal can be derived.