Validation and contents determination of (+)-catechin and diosgenin from Smilax china L. rhizome (SC) were confirmed using Ultra-Performance Liquid Chromatography (UPLC). (+)-Catechin was isolated from 60% prethanol SC extract and diosgenin was isolated by acid hydrolysis of saponin fraction from 60% prethanol extract of SC. Finally we have established the validation of the isolated compounds [(+)-catechin, diosgenin] and contents determinations of (+)-catechin and diosgenin by UPLC on 60% prethanol extract of SC [(+)-catechin: 0.06878%, diosgenin: 0.48169%], and on hot water extract of SC [(+)-catechin: 0.06584%, diosgenin: 0.42178%].
본 연구에서는 청미래 덩굴 뿌리 추출물의 미백효과를 확인하기 위해서 tyrosinase 저해활성 및 미백관련 인자인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 단백질 및 유전자 발현억제 효과를 western blot, reverse transcription-PCR 및 real time-PCR을 측정하였다. 그 결과 우수한 tyrosinase 저해활성을 확인하였고, 미백관련 인자 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 및 유전자 발현측정에서도 4가지 인자 모두 발현이 억제됨으로써 미백 효능이 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 청미래 덩굴 뿌리 추출물이 미백 효능을 가짐으로써 화장품 소재로 응용이 가능할 것으로 판단된다.
천연 항산화제 개발 연구의 일환으로 국내에서 민간약재로 사용되고 있는 청미래덩굴 뿌리의 항산화활성을 조사하였다. 건조된 청미래덩굴 뿌리를 물 및 25% 에탄올로 추출하여 얻어진 추출물을 연구시료로 사용하였다. 추출물의 얻어진 양은 건조시료 1.0 g에서 69.3 mg, 87.9 mg이 각각 얻어졌다. 추출액 1 mL를 동결건조하였을 때 얻어진 양은 23.1 mg과 29.0 mg이었다. 두 추출물의 총페놀함량은 비교적 높았으며, 건조시료 1.0 g당 약 36 mg으로 추출물간 유의적인 차이는 없었다. DPPH 라디칼 형성을 50%로 낮추는데 요구되는 추출물의 농도$(SC_{50})$는 물 추출물이 $12.1{\mu}L$, 에탄올 추출물이 $6.3{\mu}L$로 에탄올 추출물이 유의적으로 높은 DPPH 소거활성을 보였다. NO 라디칼 소거에 대한 두 추출물의 활성은 $50{\mu}L$에서 물 추출물이 약 75%, 에탄올 추출물이 88%로 에탄올 추출물이 유의적으로 높은 활성을 보였다(p<0.05). 두 추출물의 pH를 달리한 조건에서 $NO_2$ 소거활성을 조사한 결과, pH가 낮을수록 $NO_2$의 소거활성이 더 높았다. 동일농도 1 mL의 pH 4.2 및 pH 6.0에서는 에탄올 추출물이 유의적으로 높은 활성을 보였다. pH 1.2의 강산 조건에서는 물 추출물과 에탄올 추출물이 유의적인 차이를 보이지는 않았으나, 두 추출물 모두 98% 이상의 높은 $NO_2$ 라디칼 소거활성을 보였다. Vitamin C의 환원력과 비교했을 때, 0.5 mg 농도에서는 두 추출물의 환원력이 vitamin C보다 낮았으나, 0.1 mg 이하에서는 청미래덩굴 뿌리 추출물이 유의적으로 훨씬 더 높은 환원력을 보였다(p<0.01). 청미래덩굴 뿌리 추출물의 tyrosinase 활성 저해효과는 추출물 1 mL에서 물 추출물이 44.6%, 에탄올 추출물이 52.6%로 비교적 높은 저해효과를 보였다. 두 추출물의 총 페놀함량이 유의적인 차이를 보이지 않았으나, DPPH 및 NO, $NO_2$ 라디칼의 소거활성 효과, 환원력, tyrosinase 활성 저해효과는 에탄올 추출물에서 유의적으로 높았으므로 청미래덩굴 뿌리의 경우 페놀화합물 외에도 다른 성분들이 항산화에 관여하는 것으로 판단되었다.
청미래덩굴 추출물의 주름개선 효과를 확인하기 위해 elastase 저해활성을 측정한 결과 청미래덩굴 에탄올 추출물과 열수 추출물이 $1,000{\mu}g/ml$에서 각각 41.1%, 16.3%의 활성을 나타내었으며, collagenase 저해활성 측정결과 청미래덩굴 에탄올 추출물과 열수 추출물이 $1,000{\mu}g/ml$에서 각각 96.6%, 60.0%의 활성을 나타내었다. 청미래덩굴의 에탄올 추출물의 세포생존율을 확인하기 위하여 섬유아세포(CCD-986sk)로 MTT assay에 의해 확인한 결과 $50{\mu}g/ml$ 농도에서 71.7%의 세포 생존율을 확인할 수 있었다. 섬유아 세포에서 청미래덩굴 에탄올 추출물의 pro-collagen type-1 생합성량을 확인한 결과 $50{\mu}g/ml$의 농도에서 139% 이상의 우수한 효과를 나타내었으며, MMP-1 저해활성을 측정한 결과 $50{\mu}g/ml$의 각각의 농도에서 74.9%의 활성을 나타내었다. 청미래덩굴 에탄올 추출물을 처리한 섬유아 세포에서 MMP family 중 MMP-1의 단백질 발현 및 mRNA 발현 억제 효과를 확인한 결과 MMP-1 단백질 발현과 mRNA 발현 모두 $50{\mu}g/ml$에서 각각 35%, 45%의 저해율을 나타내었다. 이러한 결과로 미루어 보아 청미래덩굴 에탄올 추출물이 주름개선용 화장품 소재로 응용이 가능할 것으로 판단된다.
식품 연구에서 흔히 사용되는 물과 주정(70% 에탄올)을 사용하여 추출된 발계(SCR)의 열수 추출물(SCRW)과 에탄올 추출물(SCRW)의 총 플라보노이드 및 폴리페놀 함량, 항산화 활성, 항암활성을 측정하였다. SCRW와 SCRE는 DPPH(SCRW; 72.9%, SCRE; 42.4%)와 ABTS(SCRW; 81.6%, SCRE; 50.3%) 자유 라디칼을 효과적으로 소거하였으며, 양성 대조군인 BHA(53.8% DPPH, 49.5% ABTS)보다 더 높은 소거활성을 나타냈다. 또한 인체 유래 신장 정상세포(HEK293)에 대해서는 높은 생존율을 나타내 독성이 없음을 확인한 반면, 인체 유래의 암세포(유방암세포; MCF-7, 폐암세포; A549, 위암세포; AGS)에 대해서는 대조군으로 사용된 항암제 CPA와 유사하거나 더 높은 세포성장 억제효과가 확인되었다. 특히 SCRE는 AGS에 대하여 $1,000{\mu}g/mL$ 농도에서 53.6%로 탁월한 위암 세포 성장저해 효과를 나타냈다. 본 연구 결과를 통해, 발계 추출물의 높은 항산화 및 항암 활성이 확인되어 약리활성에 대한 기초연구 자료로 제시 할 수 있을 것으로 사료되며, 기능성 소재로써의 이용 가치를 높일 수 있을 것으로 판단된다.
Rhizoma of Smilax china has been used as anti-inflammatory and analgesic, antiedemic agent in Korean folk medicine. In order to investigate the efficacy of anti-oxidative activity, the activity-guided fractionation and the isolation were performed. Each fractions ($H_2O$ fraction, 20%, 40%, 60%, 100% MeOH fractions and CHCl$_3$ fraction) was examined antioxidant activity by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging potential. It was revealed that 40%, 20% MeOH fractions and $H_2O$ fractions have significant anti-oxidative activity. From 40% and 20% MeOH fractions two flavonoid glycosides and one procyanidin were isolated and elucidated apigenin-7-Ο-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl(1\longrightarrow2)-$\beta$-D-glucopyranoside, apigenin-7-Ο-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl(1\longrightarrow6)-$\beta$-D-glucopyranoside and catechin(4$\alpha$\longrightarrow6)epicatechin through their physicochemical data and IR, FAB-MS, $^{13}$ C-NMR, and $^1$H-NMR analysis with authentics, respectively. The isolated compounds were examined by DPPH method. Apigenin-7-Ο-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl(1\longrightarrow2)-$\beta$-D-glucopyranoside and catechin (4$\alpha$\longrightarrow6) epicatechin showed powerful radical scavenging activities on DPPH radical among three compounds.
Aspergillus oryzae로 발효시킨 청미래덩굴(Smilax china L) 잎열수추출물(FSCL)의 첨가가 토복령 열수추출물(SCLR)의 항산화능에 미치는 영향을 조사하기 위하여 각 2% 열수추출물을 0:100 (A), 20:80 (B), 40:60 (C), 60:40 (D), 80:20 (E), 100:0 (F) (v/v)의 조건으로 혼합하였을 때 total polypheno l(TP) 및 total flavonoid (TF) 함량, $OD_{475}$, 전자공여능(EDA), 철환원력(FRAP), xanthine oxidase (XO) 및 aldehyde oxidase (AO)에 대한 저해활성과 관능적 품질을 조사하였다. A와 F의 TP 함량은 각각 3.78 및 9.37 mg/100 mL, TF 함량은 각각 0.24 및 1.84 mg/100 mL로 FSCL이 SCLR에 비하여 TP는 2.48배, TF는 7.67배가 높았으며 FSCL의 첨가비율이 높아질수록 비례적으로 높았다($R^2=0.9887$, $R^2=0.9592$). $OD_{475}$는 FSCL의 첨가비율이 높아질수록 거의 비례적으로 높은 흡광도를 나타내었다($R^2=0.9850$). EDA (% at mL)는 A (25.75%)에 비하여 F (54.63%)에서 2.12배가 높았으며 FSCL의 첨가비율이 높을수록 높아지는 경향을 보였다($R^2=0.9668$). FRAP ($Fe^{2+}{\mu}mole/g$ of dry basis)의 경우도 EDA와 마찬가지로 A (1.18)에 비하여 F (4.92)에서 4.17배가 높았으며, FSCL의 첨가비율이 높아질수록 비례적으로 높았다($R^2$=0.9907). A의 XO에 대한 저해활성(mg/mL of $IC_{50}$)은 1.19로 F의 2.96에 비하여 59.80%가 높았으며, FSCL의 첨가비율이 높아질수록 비례적으로 감소하였다($R^2$=0.9490). 그러나 AO에 대한 저해활성(mg/mL of $IC_{50}$)은 XO의 경우와 반대로 A (3.37)에 비하여 F (1.41)에서 58.16%의 높은 저해활성을 나타내었으며, FSCL의 첨가비율이 높아질수록 높아지는 경향을 보였다. 향에 대한 기호도는 A와 F에서는 각각 2.77 및 2.72점으로 비슷한 값을 보였으며 발효청미래덩굴잎 열수추출물을 20-80 비율로 혼합하였을 때는 다소 향상되는 경향을 나타내었으나 상호간의 유의적인 차이는 없었다. 그러나 40% 혼합(C) 하였을 때는 무첨가 경우(A 또는 F)에 비하여 유의적으로 향상되었다. 맛에 대한 기호도는 F에 비하여 A에서 다소 높은 값을 나타내었으며 C에서 가장 높은 값을 나타내었다. 색상에 대한 기호도는 40-80% 첨가한 경우가 A, F 및 B보다 높았다. 입맛과 종합적인 품질에 대한 기호도는 C, D에서 가장 높았다. 이상의 결과 A. oryzae로 발효시킨 청미래덩굴잎의 열수추출물은 보이차 스타일의 적갈색을 나타내며, 토복령 열수추출물과 혼합함으로써 음료로서의 기호성이 높아짐과 동시에 EDA 및 FRAP와 같은 항산화활성이 높아지나, ROS 생성계 효소로 알려져 있는 XO와 AO의 활성 억제현상은 상반된 결과를 나타내고 있어 이와 관련된 기능성 식품 개발에 대한 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 생각한다. 그러나 현재 실험의 결과만으로는 어떠한 성분이 이러한 항산화활성의 변화에 관여하는지는 확인할 수 없으며 추후 계속적인 연구 검토가 필요하다.
본 연구는A oryzae 발효시킨 청미래덩굴잎의 차로서의 최적 물 추출조건을 확립하기 위하여 농도, 추출온도 및 추출시간을 독립변수로 하고, 종속변수로는 항 통풍 및 항 알코올성 복부비만과 같은 청미래덩굴 본래의 기능성과 관련하여 total polyphenol(TP) 및 total flavonoid(TF) 함량, 발효에 의하여 생성되는 색상물질의 함량($OD_{475}$), xanthine oxidase 및 aldehyde oxidase 저해활성(XOI 및 AOI)을 측정함과 동시에 차로서의 품질과 관련이 있는 색상, 수용성 고형물의 양, 전자공여능(EDA) 및 종합적인 기호도(OA)를 반응표면분석법(response surface methodology)을 통하여 예측하였다. 반응표면에 대한 이차다중회귀방정식의 결정계수($R^2$)는 EDA(0.69), XOI(0.78)을 제외하고는 모든 종속변수들이 0.85~0.98범위로 높은 적합도를 나타내었다. 그러나 EDA와 XOI의 활성은 저 농도에서도 비교적 높은 활성을 나타내었다. 결정계수가 0.8이상으로 나타난 종속변수에 대하여 반응표면분석을 행한 결과 모든 변수들에서 다 같이 농도가 추출에 가장 큰 영향을 미쳤으며 TP, $a^*$ 및 $b^*$값, $OD_{475}$, WSS 및 AOI는 1%수준에서 유의성을 나타내었고, OA는 5%수준에서 유의성을 나타내었다. 추출온도의 경우는 $a^*$ 및 $b^*$, $OD_{475}$, WSS의 함량이 5%수준에서 유의성을 나타내었다. 청미래덩굴잎의 기능성과 관련하여 가장 중요한 요소의 하나인 AOI는 농도 2.19%, 추출온도 $90.02^{\circ}C$, 추출시간 4.03 min이 최적 조건으로 나타났으며 이때의 AOI 값은 59.48% ($R^2$: 0.93, p<0.007) 이었다. 통풍과 음주에 의한 복부비만과 관련이 있는 XO와 AO의 저해활성을 뒷받침하는 TP 및 TF 함량, $OD_{475}$ 그리고 차의 품질과 관련된 색상 및 종합적인 기호도 등 모든 종속변수를 만족시킬 수 있는 최적 물 추출조건의 범위는 농도 1.6~1.8%, 추출온도 $83{\sim}93^{\circ}C$, 추출시간 3.4~4.4 min이었으며 최적조건은 농도 1.7%, 추출온도 $88^{\circ}C$, 추출시간 3.9 min 이었다.
본 연구에서는 천연 항균소재로 알려진 청미래덩굴의 잎, 뿌리, 싹과 줄기를 이용하여 청미래덩굴 추출물의 항균성과 망개떡의 저장성 향상에 관한 연구를 하였다. 시판 망개떡으로부터 미생물을 분리하였으며, 열처리 후 생균수를 측정함으로써 열에 저항성이 강한 식품의 주요 부패 미생물로 알려진 $Bacillus$속 균주가 망개떡 부패의 원인균주임을 확인할 수 있었고, 16S rRNA로 동정한 결과 $Bacillus$$subtilis$ 균주가 우점종임을 확인하였다. 따라서 $Bacillus$$subtilis$가 망개떡 부패를 유발하는 원인균주로 사료된다. 망개떡의 청미래잎, 떡피, 팥소 부위 중 떡피 부분에서 가장 많은 생균수를 확인 할 수 있었고, 열처리 후에는 망개떡의 팥소 부위에 가장 많은 미생물이 존재함을 확인할 수 있었다. 망개떡의 부패 지연을 위해 천연항균소재인 청미래 덩굴의 잎, 뿌리, 싹과 줄기를 에탄올로 추출한 후 농축하여 전분함유 식품의 주요 부패미생물로 알려져 있는 $Bacillus$$cereus$를 피검균주로 하여 항균성을 조사한 결과, 뿌리에서 가장 높은 항균 효과를 확인 할 수 있었다. 또한 청미래덩굴 뿌리 추출물의 농도가 높을수록 항균성이 우수하게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 뿌리 추출물 5%를 첨가하여 생육저해환의 직경을 확인한 결과 12.90 mm로 최대값을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 이상의 결과를 바탕으로 망개떡의 팥소에 청미래덩굴 뿌리 추출물을 5% 첨가한 결과 시판 망개떡의 팥소에 비해 미생물의 생육이 현저하게 저해되는 것으로 나타났다. 따라서 망개떡의 팥소에 청미래덩굴 추출물 5%를 첨가하여 망개떡을 제조한다면, 시판되는 망개떡의 저장기간과 유통과정에 있어서의 부패에 대한 문제점을 개선할 수 있을 것이라 사료된다.
본 연구에서는 다양한 사람의 암세포주(A-549, MCF-7, MDA-MB-231, U87-MG, AGS, MKN-74 및 SNU-601 세포)와 정상세포주(MRC-5 섬유아세포 및 사랑니 유래 중간엽성 줄기세포에 토복령 추출물(Smilax china L. extract, SCLE)을 처리하여 세포 사멸 효과를 조사하였다. SCLE 처리 후, MTT 분석에서 여러 암세포주는 정상세포주보다 유의적으로 휠씬 낮은 반억제농도값을 나타내었고, 세포는 세포부착력의 소실로 인한 세포사멸(anoikis)이 관찰되었다. 또한, SCLE를 처리한 A-549, AGS 및 MCF-7 암세포주에서 세포의 생존성과 말단소립 복원효소의 활성도를 조사하였을 때, SCLE 처리 후 4일째에 세포의 생존성과 말단소립 복원효소의 활성도가 현저히 줄어드는 것을 관찰하였다. 또한, SCLE를 처리한 A-549, AGS 및 MCF-7 암세포주에서 세포 주기의 G1기에서 세포 성장이 정지되었고,세포 사멸이 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있었다. 그러나, SCLE 처리는 rho 단백질의 활성과 관련 없는 세포부착력의 소실과 세포 사멸이 유도되는 것을 관찰하였다. 이 연구의 결과를 바탕으로 토복령 추출물은 정상 세포보다는 암세포에 특이적으로 세포부착력의 소실과 세포 사멸을 유도하여, 이 추출물에 포함된 물질을 이용한 항암 연구에 응용될 수 있을 것으로 판단된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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