• 한국작물학회지
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• 제65권4호
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• pp.496-507
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• 2020

본 연구는 사과 바이러스 ASGV, ASPV 및 ApMV를 각각 정밀하게 진단하고자 SYBR Green I 및 TaqMan probe, 두 종류의 다른 chemical dye를 사용하여 quantitative real-time PCR 검정법을 개발하고자 하였다. 1. 사과 바이러스 ASGV, ASPV 및 ApMV의 국내분리주를 바탕으로 하여 cloning 및 in vitro transcription을 수행해 10배 희석단위 표준시료를 제작하였다. 각 바이러스에 대한 SYBR Green I용 프라이머와 TaqMan probe용 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 2. 상기 제작된 프라이머와 프로브를 이용해 표준시료를 대상으로 real-time PCR을 수행하여 각 바이러스의 증폭곡선과 검량선을 구할 수 있었다. Real-time PCR 결과, SYBR Green I기반의 검정법은 TaqMan probe기반의 검정법 못지 않은 결과를 보여주었으며, 적은 비용에 대량 검정이 요구되는 곳에 효과적으로 응용될 수 있을 것이다. 3. 현장평가를 본 실험에서 개발된 TaqMan probe기반의 real-time PCR검정법과 기존의 RT-PCR검정법과 비교분석하였다. 그 결과 real-time PCR 검정법은 singleplex 및 multiplex RT-PCR보다 더 민감하고 정확한 결과를 내어 RT-PCR로 검출할 수 없는 농도까지 검정할 수 있음을 입증하였다. 4. 본 실험에서 개발한 real-time PCR검정법은 검역현장과 같은 대량의 검사가 요구되는 곳에서는 SYBR Green I 기반의 검정법을, 바이러스 연구분야에서는 세밀한 정량이 가능한 TaqMan probe 방식의 검정법이 활용될 것으로 기대한다.

• Environmental Engineering Research
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• 제14권1호
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• pp.63-67
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• 2009

Escherichia coli K-12 (E. coli K-12) is a representative indicator globally used for distinguishing and monitoring dynamic fates of pathogenic microorganisms in the environment. This study investigated how to most critically quantify lacZ ($\beta$-galactosidase) gene in E. coli K-12 by two different real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) in association with three different DNA extraction practices. Three DNA extractions, i.e., sodium dodecyl sulfate (SDS)/proteinase K, magnetic beads and guanidium thiocyanate (GTC)/silica matrix were each compared for extracting total genomic DNA from E. coli K-12. Among them, GTC/silica matrix and magnetic beads beating similarly worked out to have the highest (22-23 ng/${\mu}L$) concentration of DNA extracted, but employing SDS/proteinase K had the lowest (10 ng/${\mu}L$) concentration of DNA retrieved. There were no significant differences in the quantification of the copy numbers of lacZ gene between SYBR Green I qPCR and QProbe-qPCR. However, SYBR Green I qPCR obtained somewhat higher copy number as $1{\times}10^8$ copies. It was decided that GTC/silica matrix extraction or magnetic beads beating in combination with SYBR Green I qPCR can be preferably applied for more effectively quantifying specific gene from a pure culture of microorganism.

• 한국산학기술학회논문지
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• 제22권1호
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• pp.431-438
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• 2021

본 연구는 향후 보다 강화될 것으로 예측되어지는 USCG Phase II 형식승인시험을 대비하기 위해 SYBR Green I과 SYBR Gold의 염색 효율을 비교한 후 염색 효율이 높은 시약을 실제 선박평형수처리장치(electrolysis type, UV + electrolysis type)를 통과한 처리수에 적용해서 보았다. 시료의 부피가 0.5 mL ~ 2 mL, 염색 시약(Stock solution)을 100배 및 200배 희석한 조건에서 염색된 바이러스가 가장 선명하게 관찰되었다. SYBR Green I과 SYBR Gold의 염색효율은 장목한 해수조건의 실험구에서 유의한 차이를 보이지 않았지만, SYBR Gold의 노란색에 비해 SYBR Green I으로 염색된 시료에서 발현하는 녹색 형광이 보다 선명해서 관찰이 용이한 것으로 확인되었다. 선박평형수처리장치(electrolysis type, UV + electrolysis type)를 통과하지 않은 실험수 및 대조수에서의 해양 바이러스 현존량은 약 109~1010 VLP 100 mL-1 으로 확인된 반면, 처리수에서는 살아 있는 바이러스가 관찰되지 않았다. 실험수 결과를 보면, SYBR Green I은 해수, 기수, 담수 조건에서 효과적으로 염색이 되는 것으로 확인되었다. 다양한 선박평형수처리기술에 따른 추가적인 검증 및 염색 방법 개발이 필요하지만, SYBR Green I 염색법은 USCG Phase II 미국형식승인시험 바이러스 생산판별에 좋은 대안이 될 수 있을 것으로 판단된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제33권2호
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• pp.148-153
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• 2005

말라리아는 세계적으로 다시 발생하는 감염성 질환으로 모기에 의해 옮겨지는 말라리아 원충에 의해서 발병한다. 말라리아 원충을 검출하기 위하여 혈액 도말법 등 여러 가지 정량적인 assay가 활용 되고 있다. Real time PCR 은 반응이 일어나는 동안 PCR 산물의 생성을 계속적으로 모니터링 할 수 있는 방법으로서 최근 많은 환자들의 말라리아 원충을 한번에 탐지 하는데 적용되고 있다. 본 연구에서는 말라리아 원충 중 한국에서 질환을 일으키는 Plasmodium vivax를 탐지하기 위해 26명의 환자 혈액에서 분리 정제한 genomic DNA를 가지고 SYBR Green based-real time PCR을 수행하였다. 특히, 기존의 real time PCR에 사용한 18S rRNA와는 달리 DBP 유전자를 사용하여 새로운 말라리아 검출방법을 정량적이면서도 간편하고 경제적인 방법으로 개발하였다. 특히, real time PCR로 나온 결과를 임상적인 titer로 바꾸어 주기 위해서 reference 유전자로는 말라리아 환자의 상태와 관계없이 ACTB이 안정하다는 것을 real time PCR로 입증하였고 ACTB 유전자를 reference 유전자로 사용하였다. 본 연구에서는 real time PCR assay에 DBP라는 유전자를 처음 사용하였을 뿐 아니라 titer 보정을 위한 reference 유전자, ACTB를 real time PCR assay을 통해 확보하여 더 정확한 titer 값을 얻고자 했다. 이런 결과를 바탕으로 Taqman based-real time PCR과 본 연구의 결과를 정량비교를 하였다. 특히, 26명의 말라리아 환자 샘플을 3 group(Group I, II, III)로 나누어서 그 결과 정량적인 경향성 일치를 나타내었다. 특히, 높은 titer을 갖는 말라리아 샘플(Group I)에서 가장 많은 정량적인 차이를 보였지만, 간편하고 경제적인 SYBR Green-based real time PCR을 이용하여 DBP 유전자를 증폭하는 새로운 방법으로 말라리아를 Semi-quantitative 하게 검출할 수 있음을 보였다.

• 생명과학회지
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• 제24권4호
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• pp.428-436
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• 2014

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)법은 등온에서 DNA 주형을 변성시키지 않고 실시하기 때문에, autocycling 가닥 변위 DNA 합성에 의존한다. 그래서 고가의 PCR 장비를 필요로 하지 않고 등온 유지가 가능한 저가의 장비인 항온 수조, 오븐, 온장고 등에서 증폭이 가능하다. 본 연구진은 Streptococcus parauberis의 random primer중에서 5개를 선정하여, 신장도가 높은 2개의 primer를 이용하여 최적 반응온도 및 최적 반응시간, 최적 반응 조건들을 확립하였다. 그리고 기존의 PCR과 LAMP의 민감도의 비교 분석을 측정한 결과, LAMP의 높은 검출 한계를 확인할 수 있었다. 본 논문에서는 non-target DNA의 영향을 받지 않고 등온 조건 하에서 DNA를 증폭시킬 수 있는 LAMP법과 SYBR-green I를 이용하여 시각화시켰으며, 기존의 PCR과 비교 분석함으로써, S. parauberis에 대한 신속하고 정확한 진단법을 확립하였다.

• 대한임상검사과학회지
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• 제48권2호
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• pp.88-93
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• 2016

선형 사상충의 일종인 심장사상충은 개의 심폐 사상충증을 유발한다. 이에 본 연구의 목적은 심장사상충을 효과적으로 검출할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응 기법을 개발함에 있다. 연구에 있어서 사용된 프라이머 및 프로브는 선행연구에서 제작된 심장사상충 특이 프라이머 및 새롭게 제작된 TaqMan 프로브를 이용하였다. 선행연구에서 제작된 프라이머 및 농도별로 희석된 게놈유전자와 플라스미드유전자가 SYBR Green 실시간 중합효소연쇄반응 수행에 이용되었으며, 중합효소연쇄반응 과정 중 증폭 이후의 녹는 곡선의 결과를 분석하였다. 분석결과 사용된 프라이머는 각각 게놈유전자 및 플라스미드 유전자에서 특이 녹는 곡선을 나타냄에 따라 심장사상충 특이 사이토크롬 C 산화효소 유전자만을 증폭하고 있음을 확인 할 수 있었다. 새롭게 제작된 TaqMan 프로브는 SYBR Green 실시간 중합효소연쇄반응과의 결과를 농도별로 희석된 플라스미드 유전자를 이용하여 비교 분석하였고, 분석결과 TaqMan 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응이 검출효율 및 특이도에 있어서 우수함을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 개발한 실시간 중합효소연쇄반응은 기존의 전통적인 진단기법의 한계를 극복할 수 있는 신속하고 정확한 향상된 진단기법을 제시한다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제33권4호
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• pp.280-288
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• 2018

본 연구는 국내에서 생산되거나 해외에서 수입되어 국내에서 유통되는 수산물 중에서 두족류를 문어류, 낙지류, 오징어류, 주꾸미류, 꼴뚜기류의 5개 그룹으로 구분하여 분석하였다. 두족류 5개 그룹을 판별을 하기 위해 미토콘드리아에 존재하는 유전자를 분석하였고, 그 중에서 COI (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I), 16s rRNA (16s ribosomal RNA), 12s rRNA (12s ribosomal RNA) 내에서 상당히 유사한 DNA 서열 부분과 일부 서열 변화 부분이 확인되었다. 명확하게 두족류 5개 그룹 판별을 하기 위해 COI, 16s rRNA, 12s rRNA 유전자의 일부 서열 변화 부분에서 그룹 특이적 프라이머 세트를 디자인하였다. 국내 외에서 확보한 두족류 시료(참문어, 낙지, 살오징어, 아메리카 대왕오징어, 갑오징어, 주꾸미, 모래주꾸미, 하이야주꾸미, 참꼴뚜기, 창꼴뚜기, 한치꼴뚜기)의 genomic DNA을 추출하여 각 그룹의 특이적 프라이머를 이용하여 SYBR 기반의 real-time PCR 시스템에 의해 분석되었고, threshold cycle (Ct) value와 같은 real-time PCR 결과 분석에 의해 두족류 내 그룹 판별이 가능하였다(Table 3).

• 대한화학회지
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• 제57권1호
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• pp.81-87
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• 2013

황색포도상구균은 병원에 의한 감염, 혈류 감염을 포함하는 중요한 병원체이다. 특히, 포도상구균의 혈액 수집의 신속한 동정과 메치실린 내성이 일어나게 되면 폐혈증으로 추측되어 진다. 본 저자는 적은 양의 핵산을 등온증폭반응에 적응시켜 증폭산물을 SYBR Green I을 결합하여 염기서열에 특이적으로 검출할 수 있는 새로운 방법을 제시하고 있다. 그리고 이 독특한 유전자 증폭방법은 등온의 상태에서 하나의 효소만으로 증폭이 가능하다. 포도상구균-등온증폭반응은 황색포도상구균에 특이적인 protein A를 암호화하는 spa 유전자와, 메치실린 내성인 pennicillin-binding protein-2를 암호화하는 mecA 유전자를 타겟으로 하여 MRSA와 MRSE를 검출하였다. 본 연구에서는 등온증폭법을 사용하여 황색포도상구균과 표피포도상구균의 임상샘플을 검출하였다. 황색포도상구균과 표피포도상구균을 10배위 정량 희석하여 시리즈별로 샘플을 만들어 실험을 수행하였다. 칩을 기반으로 하는 LAMP법은 포도상구균 감염여부를 쉽고, 빠르고, 정확하게 민감도 있는 검출을 가능하게 해 주었고, 샘플을 측정할 수 있는 한계값을 넘는 상황에 특이적으로 적용할 수 있다.

• Toxicological Research
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• 제21권3호
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• pp.219-226
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• 2005

• 한국환경과학회지
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• 제18권12호
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• pp.1331-1338
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• 2009

Marine dinoflagellate Alexandrium minutum producing paralytic shellfish toxins is responsible for paralytic shellfish poisoning (PSP). To investigate its temporal distributions in Chinhae Bay where PSP occurs annually, SYBR Green I based A. minutum-specific real-time PCR probe was developed on the LSU rDNA region. Assay specificity and sensitivity were tested against related species, and its specificity was further confirmed by sequencing of field-derived samples. Ten months field survey in 2008 (a total 100 surface water samples) by using the real-time PCR probe showed that A. minutum was detected at very low densities of 1-4 cells $L^{-1}$ in May and June being spring in Chinhae Bay, Korea.