발아 후 8일된 해녀콩 자엽에서 성질이 서로 다른 두 개의 homoserine dehydrogenase를 분리하였다. 자엽에서 얻은 조효소액을 열처리, 황산 암모늄 침전, DEAE-Sephacel 및 Sephacryl S-300 겔 크로마토그래피와 Procion red dye, Cibacron blue dye 및 Resource Q 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 겔 크로마토그래피에서 얻은 2개의 활성분획 중 T-형(트레오닌 감수성)과 K-형(트레오닌 비감수성)의 분자량은 각각 230 kD과 135 kD이었다. 10mM 트레오닌 첨가로 T-형 효소는 70% 이상의 활성저해를 받았으나 K-형 효소는 전혀 억제를 받지 않았다. Homoserine에 대한 Km은 T-형이 1.6mM, K-형이 0.3mM이었고, NAD에 대한 Km은 T-형이 2.34mM, K-형이 0.03mM이었으며 NADP에 대한 Km은 두 효소에서 동일하게 0.01mM로 산출되었다. 400mM KCl에서 T-형은 4.9배, K-형은 2.8배의 활성증가를 보였다. 부분정체(Sephacryl S-300 겔 크로마토그래피)된 상태의 T-형과 K-형은 조건에 따라 쉽게 상호전환되었다.
Glutamic acid의 분해능이 뛰어난 aminopeptidase를 생산하는 세균을 토양으로부터 분리하였다. 이 균은 형태적 생리적 특성으로부터 Bacillus licheniformis로 동정되었다. 이 균을 최적 배지에 접종하고 37$^{\circ}C$에서 진탕배양한 후 균이 생산한 aminopeptidase를 ammonium sulfate 침전, Phenyl Sepharose CL-4B, Resource Q, Superose 12HR column을 통해 분리하여서 20.6%의 수율로 17.6배 정제된 glutamyl p-nitroanilide을 기질로 했을 때 9.2unit/mg의 순수효소를 얻었다. SDS-PAGE와 Native-PAGE로 부터 이 효소의 분자량이 42,000Da와 22,000Da으로 구성된 헤테로다이커로 약 64,000Da임이 밝혀졌고 효소의 등전점은 5.2로 나타났다. 이 효소의 반응 최적 온도는 55$^{\circ}C$, 반응최적 pH는 8.0이었고, EDTA와 1,10-phenanthroline에 의해서 효소활성이 저해되는 metalloenzyme으로 판명되었다.
방선균은 토양속에 서식하는 그람 양성 세균으로 세포성 장의 어느 시기에 영양세포가 이어져 연쇄상의 기균사를 형성하고 그 끝에 포자를 형성하는 동시에 생리학적 분화로 표현되는 다양한 이차대사물질을 생산한다. 이들의 복잡한 생활사에 따른 분화에는 진핵생물의 ser/thr protein kinase와 원핵생물의 his/asp acid protein kinase 등과 같은 다양한 신호전달 단백질들이 조절을 담당하고 있다. Akt kinase는 진핵생물에서 보고된 ser/thr kinase로.세포내의 다양한 신호전달기구를 조절하고 있으며, 세포내의 Akt kinase의 활성화 또는 불활성화가 세포 증식, 분화, 생존, 세포사등의 신호전달에 결정적인 역할을 담당한다. 방선균으로부터 Akt kinase와 유사한 기능을 갖는 신호전달 단백질을 규명하기 위하여, Akt kinae의 target단백질들의 인산화 부위 보존영역으로부터 나타나는 아미노산의 consensus sequence를 기초로 하여 형광물질로 라벨시킨 합성 peptide(FITC-TRRSRfESIT)를 제작하였다 제작한 기질 peptide에 인산화가 일어나면 아가 로스 전기영동상에서의 운동성에 차이가 나타나고, 이를 자외선하에서 형광 peptide를 관찰하는 방법으로 인산화 assay를 실시하였다. S. griseus IFO 13350을 배양한 cell-free extract로부터 ammonium sulfate fractionation과 DEAE-Sepharose, Mono Q, Resource Phenyl-Superose, Gel permeation 등 수 단계의 column chromatography를 통하여 Akt 유사 단백질을 정제하였다. 그 결과 방선균에도 고등생 물의 Akt와 유사한 기질특이성을 갖는 인산화 단백질이 존재하는 것으로 판단되었으며, 그 중의 하나는 분자량이 39 kDa 정도의 크기를 갖는 단백질로 판명되었다. 지금까지의 인산화 단백질 연구는 활성측정법이 어려워 연구자들에게 많은 제한을 주어 왔지만, 본 연구에서 사용한 합성 peptide를 이용하는 방법을 보다 다양한 인산화 단백질에 대하여 적용한다면, 인산화 단백질 및 조절물질 개발에 많은 도움이 될 수 있을 것으로 예상된다.
본 연구에서는 피트모스(Canadian Sphagnum peat moss)로부터 추출한 피트-휴민 (p-Humin)입자를 충전한 칼럼의 연속흐름 조건하에서의 중금속 이온(Cd, Cu, Pb)의 흡착 및 탈착효율을 조사하였다. p-Humin 충전 칼럼은 단일 성분 및 혼합 중금속 용액 모두에서 높은 중금속 제거효율을 보였으며, 실험 결과는 Thomas 모델식을 적용하여 p-Humin의 중금속 흡착특성에 대한 기초 자료를 산출하였다. 단일 성분 중금속 용액을 대상으로 한 실험 결과, p-Humin 단위 그램당 Cd, Cu 및 Pb의 최대 흡착량($q_0$)은 각각 138.8, 44.66 및 41.61 mg/g으로 나타났다. 혼합 중금속 용액을 대상으로 각 중금속 이온의 경쟁흡착 반응실험 결과, p-Humin에 대한 중금속 이온의 친화력 세기는 Pb $\gg$ Cu > Cd이었다. 흡착된 금속이온은 0.05 N $HNO_3$ 용액을 사용하여 쉽게 탈착시켜 회수할 수 있었으며, 회수율은 약 95% 이상을 나타냈다. 본 연구를 통해 p-Humin은 친환경적이고 경제적인 생흡착제로서 폐수 중 중금속 이온의 제거에 활용 가능함을 확인하였다.
청미래덩굴 뿌리(Smilacis rhizoma)로부터 칼슘과 결합하는 물질을 분리하고자 열수로 추출한 추출물을 ion exchange, normal-phase HPLC 및 gel filtration chromatogarphy를 이용하여 칼슘 결합 물질을 순차적으로 분리하였다. 그 결과 ion exchange chromatography에서 7개의 major peaks를 얻었으며, 이 중 F6 fraction이 0.083 mM로 칼슘과 가장 높은 결합력을 가졌다. 또한 F6를 $NH_2$ column으로 분획한 결과 F61에서 0.130 mM의 가장 높은 칼슘함량을 나타내었으며, 최종적으로 $Superdex^{TM}$를 이용하여 F611 fraction으로 분리하였다. 따라서 청미래덩굴 뿌리 추출물 중 F611 fraction을 이용하여 biomineral을 제조함으로써 칼슘 보충제나 기능성 성분의 원료로써 식품산업에 활용될 수 있다고 판단된다.
BACE2 is a membrane-bound aspartic protease that is highly homologous with BACE1. While BACE1 processes the amyloid precursor protein (APP) at a key step in generating ${\beta}$-amyloid peptide and presumably causes Alzheimer's disease (AD), BACE2 has not been demonstrated to be involved in APP processing directly, and its physiological functions are unknown. To determine its function and to develop inhibitors from marine sources, we constructed an overexpression vector for producing BACE2. The gene encoding human BACE2 protease was amplified using the polymerase chain reaction and cloned into the pET11a expression vector, resulting in pET11a/BACE2. Recombinant BACE2 protease was overexpressed successfully in E. coli as inclusion bodies, refolded using the rapid-dilution method, and purified via two-step fast protein liquid chromatography using Sephacryl S-300 gel filtration and Resource-Q column chromatography. The BACE2 protease produced was an active form. This study provides an efficient method not only for studying the basic properties of BACE2, but also for developing inhibitors from natural marine sources.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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