• 한국수정란이식학회지
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• 제25권2호
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• pp.111-116
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• 2010

Sperm chromatin integrity is essential for successful fertilization and development of an embryo. Reported here is a quantification of DNA fragments which is intimately associated with reproductive potential to provide one of criteria for sperm chromatin integrity. Three sperm populations were considered: CONTROL (no treatment), UV irradiation (48mW/$cm^2$, 1h) and $H_2O_2$ (oxidative stress induced by hydrogen peroxide, 10 mM, 50 mM and 100 mM). DNA fragments in boar sperm were evaluated by using ligation-mediated quantitative real-time polymerase chain reaction (LM-qPCR) assay, which relies on real-time qPCR to provide a measure of blunt 5' phosphorylated double strand breaks in genomic DNA. The results in agarose gel electrophoresis showed no significant DNA fragmentation and no dose-dependent response to $H_2O_2$. However, the remarkable difference in shape and position was observed in melting curve of LM-qPCR. This result supported that the melting curve analysis of LM-qPCR presented here, could be more sensitive and accurate than previous DNA fragmentation assay method.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제22권10호
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• pp.1350-1358
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• 2012

Viral pathogens, alongside other pathogens, have major effects on crustacean aquaculture. Hepatopancreatic parvovirus (HPV) is an emerging virus in the shrimp industry and has been detected in shrimp farms worldwide. The HPV genome has greater diversity than other shrimp viruses owing to its wide host range and geographical distribution. Therefore, developing diagnostic tools is essential to detect even small copy numbers from the target region of native HPV isolates. We have developed two easy to use quantitative real-time PCR kits, called Green Star and Dual Star, which contain all of the necessary components for real-time PCR, including HPV primers, using the primers obtained from the sequences of HPV isolates from Korea, and analyzed their specificity, efficiency, and reproducibility. These two kits could detect from 1 to $1{\times}10^9$ copies of cloned HPV DNA. The minimum detection limits obtained from HPV-infected shrimp were $7.74{\times}10^1$ and $9.06{\times}10^1$ copies in the Green Star and Dual Star assay kits, respectively. These kits can be used for rapid, sensitive, and efficient screening for HPV isolates from Korea before the introduction of postlarval stages into culture ponds, thereby decreasing the incidence of early development of the disease.

• 한국육종학회지
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• 제43권5호
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• pp.448-456
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• 2011

적색 과육 '홍양' 품종에서 차등발현하는 유전자를 찾기 위하여 mirror orientation selection (MOS)과 결합된 suppression subtractive hybridization (SSH) 실험을 수행하였다. 그 결과, 288개의 cDNA clone을 확보하였으며, colony PCR을 통해 192개의 positive clone을 선발하였고, 이들을 sequencing하였다. NCBI/Genbank 데이터베이스의 BLAST 검색를 이용하여 염기서열을 분석한 결과, 30개의 clone에서 기존에 알려진 유전자기능과의 유사성을 확인할 수 있었으며, 10개의 clone이 특이유전자였다. 그 중 3개의 clone(AcF21, AcF42, AcF106)은 과실 후숙과 관련된 ACC-oxidase와 상동성이 있었다. SSH의 결과를 통해 얻어진 이 유전자들의 차등발현양상을 확인하기 위하여 reverse transcription PCR(RT-PCR)과 quantitative real-time PCR(qReal-time PCR) 분석을 실시하였다. qReal-time PCR분석과 RT-PCR분석에서 모두 동일한 결과를 확인할 수 있었으며, 3개 clone 모두 '홍양'에서의 유전자발현수준이 '헤이워드'보다 더 높았다. AcF21은 다른 유전자들보다 가장 높은 발현수준을 나타내었는데, 만개 후 120일과 160일 모두 '홍양'에서의 발현수준이 높았다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제36권1호
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• pp.34-42
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• 2008

소의 혈액, 세포, 조직, 기관 등 소 유래 물질을 원료로 사용한 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제의 경우 소 유래원료 물질에 다양한 바이러스가 오염된 사례가 있기 때문에 바이러스 안전성 검증이 필수적이다. BVDV는 동물세포주, 우혈청 등에 가장 흔하게 오염되는 바이러스이다. 소 유래물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BVDV안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BVDV를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BVDV제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 BVDV real-time RT-PCR시험법을 확립하였다. BVDV에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 BVDV RNA 정량 검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양법에 의한 감염역가와 비교한 결과 real-time RT-PCR 민감도는 $1TCID_{50}/mL$이었다. 확립된 시험법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 시험법 검증을 실시한 결과 특이성 (specificity)과 재현성(reproducibility)이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time RT-PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BVDV를 오염시킨 CHO 세포주와 소 유래콜라겐에서 BVDV검출 시험을 실시하였다. BVDV를 감염시킨 CHO 세포와 세포배양 상청액에서 BVDV를 정량적으로 검출할 수 있었다. 소 유래 콜라겐에서도 $10TCID_{50}/mL$까지 정량적으로 검출할 수 있었다.

• 대한소아치과학회지
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• 제42권4호
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• pp.312-318
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• 2015

본 연구의 목적은 치과분야에서 줄기세포 공급원으로써 과잉치의 활용 가능성을 알아보고자 Real Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Real Time qRT-PCR)법을 이용하여 발치된 과잉치 치수 유래 줄기세포 (supernumerary dental pulp stem cells, sDPSCs)로부터 상아모세포로의 분화여부를 관찰해 보는 것이었다. 이를 위해 상아모세포의 대표적인 발현인자로 알려진 alkaline phosphatase (ALP), osteocalcin (OC), osteonectin (ON), dentin matrix acidic phosphoprotein 1 (DMP-1) 그리고 dentin sialophosphoprotein(DSPP)의 발현을 분화제 처리 후 0일, 8일 그리고 14일째에 각각 Real Time qRT-PCR 법을 통해 상대적인 mRNA의 발현 양을 비교하여 변화 양상을 알아보았다. 또한 Alizarin-red solution 의 염색을 통해 sDPSCs가 분화제 처리 7일, 14일, 21일 그리고 28일째에 석회화 결절을 형성하는 정도를 시각적으로 확인해 보았다. Real Time qRT-PCR 결과 분화제 처리 8일째에 가장 높은 발현 양을 보이다가 14일째에 감소하는 추세를 나타내었으며, Alizarin-red solution 염색 결과는 7일째부터 흐리게 나타나다가 14일째에는 배지 전반에 걸쳐 진하게 염색되는 소견을 보였다. 따라서, sDPSCs를 이용한 연구에서 Real Time qRT-PCR법을 위한 분화제의 처리 기간은 8일 정도가 적절하며, Alizarin-red solution 염색은 14일이 적당한 것으로 사료된다.

• 미생물학회지
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• 제44권1호
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• pp.49-55
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• 2008

흰반점 바이러스(white spot syndrome virus, WSSV)는 양식산 새우에 감염하여 대량폐사를 일으키는 전염성이 매우 강한 병원성 바이러스이다. 본 연구에서는 강화도에 위치한 대하(Fenneropenaeus chinensis) 양식장의 양식수와 양식장으로 유입되는 해수에서 WSSV를 막여과법을 이용하여 농축하였으며, 새롭게 디자인한 primer와 Taqman probe를 사용하여 정량 실시간 PCR (quantitative real-time PCR, QRT-PCR)을 적용하여 WSSV를 정량하였다. 농도표준을 사용한 QRT-PCR 결과, 제작된 primer와 probe를 이용하여 WSSV가 정확하고 민감하게 검출됨을 확인하였다. 해수에 존재하는 WSSV와 물리화학적, 생물학적 환경요인간의 상관관계를 도출하기 위하여 양식수와 해수 유입수에서 대하 양식기간인 2007년 6월부터 9월까지 총 8회에 거쳐 다양한 환경요인을 분석하였다. 양식수 1L에 존재하는 WSSV의 양은 3,814-121,545 copy였으며, 이는 분원성 enterococci ($r^2=0.9$, p=0.02), 엽록소${\alpha}$ ($r^2=0.8$, p=0.03), 생화학적 산소요구량($r^2=0.8$, p=0.07)과 상관관계를 나타내었다. 결론적으로 본 연구에서 정립된 WSSV의 농축법 및 QRT-PCR 방법은 해수에 존재하는 WSSV를 정량하는데 효과적이었으며, 해수에 존재하는 WSSV의 양은 물리화학적 환경요인보다 생물학적 환경요인과 밀접한 관련을 보였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제43권3호
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• pp.267-274
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• 2015

세포주를 이용하여 생산하는 생물의약품과 생산용 세포주는 세포 배양 과정 중에 사용되는 돼지 유래 trypsin으로 부터 외래성 돼지 유래 바이러스가 오염될 가능성이 있다. PTGV는 세포배양 유래 생물의악품 제조공정에서 오염될 수 있는 외래성 바이러스 중의 하나이다. 본 연구에서는 생물의 약품 제조공정에서 PTGV 안전성을 확보하기 위해, 세포주, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 PTGV를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 PTGV 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 TaqMan probe real-time RT-PCR 시험법을 확립하였다. PTGV에 특이적인 primer와 probe를 선별하여 PTGV 정량검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양법에 의한 감염역가와 비교한 결과 real-time RT-PCR의 검출한계는 1.10 × 10⁰ TCID₅₀/ml이었다. 확립된 시험법의 신뢰성을 보증하기 위해 시험법 검증을 실시한 결과 특이성과 재현성, 완건성이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time RT-PCR 을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 PTGV를 오염시킨 CHO-K1 세포주에서 PTGV 검출 시험을 실시하였다. PTGV를 감염시킨 CHO-K1 세포에서 세포변병효과를 관찰할 수 없었지만, 세포배양액에서 PTGV를 정량적으로 검출할 수 있었다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제29권1호
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• pp.31-39
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• 2014

본 연구에서는 FCV 현탁액에 물리, 화학적 위생처리 후 복합효소처리라는 전처리과정을 적용한 뒤 real-time RT-PCR법을 이용하여 살균효능을 분석하였다. RT-PCR 이전에 $37^{\circ}C$에서 30분 동안 PK와 RNase A를 처리함으로써 UV, 열, 염소, 에탄올, 과초산계열 제품에 의해 불활성화 된 바이러스들은 음성 결과를 나타내었고, real-time RTP-CR법을 통해 살균 효능을 정량분석한 결과, 복합효소처리를 했을 경우 무처리구보다 더 높은 살균 효능을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 Nuanualsuwan S. 등의 선행연구에서와 같이 PK와 RNase A로 전처리하는 단계를 통하여 물리, 화학적 위생처리에 의해 손상되지 않은 바이러스가 RT-PCR법에 의해 증폭되는 것을 방지함으로써 Real-time PCR법에 대한 검출 감도를 높일 수 있음을 확인하였다. 또한, FCV를 검출하기 위해 사용된 RT-PCR과 real-time RT-PCR 두 방법 중에서도 real-time RT-PCR법이 가장 신속하면서도 민감도 높은 결과로 도출되었다. 따라서, 유전자 분석 이전에 복합효소처리는 물리, 화학적 위생처리에 의해 불활성화 된 바이러스의 RNA가 transcription 또는 증폭되는 것을 방지하기 위한 수단으로 real-time RT-PCR법과 결합됨으로써 노로바이러스를 비롯한 식중독 바이러스를 검출하는데 효과적으로 적용될 것으로 판단된다. 또한 식품현장에서 전기영동 과정없이 신속하게 살아있는 바이러스만을 수치적으로 정량화함으로써 식품안전에도 기여할 것으로 사료된다.

• International Journal of Oral Biology
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• 제40권4호
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• pp.205-210
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• 2015

Prevotella intermedia-specific quantitative real-time PCR (qPCR) primers were previously designed based on the nucleotide sequences of RNA polymerase ${\beta}$-subunit gene (rpoB). However, the several clinical strains isolated from Korean populations are not detectable by the qPCR primers. The purpose of this study was to develop new P. intermedia-specific qPCR primers based on the rpoB. The specificity of the primers was determined by conventional PCR with 12 strains of P. intermedia and 52 strains (52 species) of non-P. intermedia bacteria. The sensitivity of primers was determined by qPCR with serial dilutions of the purified genomic DNAs (40 ng to 4 fg) of P. intermedia ATCC $25611^T$. The data indicated that only P. intermedia strains were detected by the P intermedia-specific qPCR primers (RTPiF2/RTPiR2); in addition, as little as 40 fg of P. intermedia genomic DNA could be detected. These results suggest that these qPCR primers are useful in detecting P. intermedia from the bacterial infectious lesions including dental plaque and oral tissue lesions.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권2호
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• pp.205-211
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• 2006

A quantitative analytical method to detect new lines of genetically modified (GM) maize, NK603 and TC1507, has been developed by using a real-time polymerase chain reaction (PCR). To detect these GM lines, two specific primer pairs and probes were designed. A plasmid as a reference molecule was constructed from an endogenous DNA sequence of maize, a universal sequence of a cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter used in most GMOs, and each DNA sequence specific to the NK603 and TC1507 lines. For the validation of this method, the test samples of 0, 0.1, 0.5, 1.0, 3.0, 5.0, and 10.0% each of the NK603 and TC1507 GM maize were quantitated. At the 3.0% level, the biases (mean vs. true value) for the NK603 and TC1507 lines were 3.3% and 15.7%, respectively, and their relative standard deviations were 7.2% and 5.5%, respectively. These results indicate that the PCR method developed in this study can be used to quantitatively detect the NK603 and TC1507 lines of GM maize.