• 한국수정란이식학회지
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• 제23권2호
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• pp.101-108
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• 2008

This study investigated the developmental ability and gene expression of somatic cell nuclear transfer embryos using ear skin fibroblast cells derived from miniature pig. When miniature pig (m) and landrace pig (p) were used as donor cells, there were no differences in cleavage (79.2 vs. 78.2%) and blastocyst rates (27.4 vs. 29.7%). However, mNT blastocysts showed significantly higher apoptosis rate than that of pNT blastocysts (6.1 vs. 1.7%) (p<0.05). The number of nuclei in pNT blastosysts was significantly higher than that of mNT (35.8 vs. 29.3) (p<0.05). Blastocysts were analyzed using Realtime RT-PCR to determine the expression of Bax-${\alpha}$, Bcl-xl, H19, IGF2, IGF2r and Xist. Bax-${\alpha}$ was higher in mNT blastocyst than pNT blastocyst (p<0.05). There was no difference in Bcl-xl between two NT groups. Bax-${\alpha}$/Bcl-xl was, however, significantly higher in mNT blastocyst compared to pNT. The expression of imprinting genes were aberrant in blastocysts derived from NT compared to in vivo blastocysts. H19 and IGF2r were significantly lower in mNT blastocysts (p<0.05). The expression of IGF2 and Xist was similar in two NT groups. However, imprinting genes were expressed aberrantly in mNT compared to pNT blastocysts. The present results suggest that the NT between donor cells derived from miniature pig and recipient oocytes derived from crossbred pig might affect reprogramming of donor cell, resulting in high apoptosis and aberrant expression patterns of imprinting genes.

• 한국수정란이식학회지
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• 제27권1호
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• pp.1-7
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• 2012

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) for miniature pig has been developed for xenotransplantation and many other biomedical experiments. However, the efficiency of SCNT is still very low due to many factors. To optimize the surrogate mother condition for improvement of cloned miniature pigs efficiency, we investigated the effect of the status of surrogate mother on pregnancy, farrowed rate in SCNT pigs. After SCNT with mesenchymal stem cells as donor cells, the SCNT embryos were surgically transferred into the oviduct of surrogated pigs. To compare the effects of status of surrogate pigs on pregnancy, surrogate pigs were prepared by artificial abortion at day 20~29 (Group 1), 30~39 (Group 2), and 40~45 (Group 3) of gestation. After SCNT embryos transfer in three different status of surrogate pigs, Group 2 (56.3%) and 3 (55.6%) had significantly ($p$ <0.05) higher the pregnancy rate than group 1 (0%) at day 30 of gestation. The status of ovulation in surrogate pig also was investigated. Post-ovulation status (54.8%) had higher proportion than pre-ovulation status (38.7%) and ovulation status (6.5%). We obtained 19 cloned miniature piglets from seven surrogate gilts and five piglets are living healthy but fourteen piglets died soon after birth or stillbirth. The weights of piglets greatly differ from 254 to 1,296 g. Microsatellite analysis showed that cloned piglets were genetically different from the surrogate mother and cloned piglets were genetically equal to the donor cell. In conclusion, the present result indicates that artificially abortion method can improve the efficiency of pregnancy after SCNT in pigs. This study will provide available method for the further study and application in the field of xenotransplantation.

• 한국수정란이식학회지
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• 제20권3호
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• pp.289-295
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• 2005

본 연구는 돼지에서 스트레스 관련 HSP70 유전자의 다형성과 IVF 수정란의 배발달간의 관련성을 조사하기 위하여 수행되었으며 그 결과는 다음과 같다. HSP70-K1, -K3 및 -K4의 PCR 산물로부터 SSCP 다형성은 각각 다르게 확인되었다. 체외수정란의 분할율 시험에서 HSP70 K1-AA($73.1\%$) 및 K1-AB($62.3\%$) 난할율은 HSP70 K1-BB($49.3\%$)보다 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). 또한 HSP70 K3-AA($72.4\%$) and K3-AB($62.2\%$)형도 HSP70 K3-BB($49.1\%$)형보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 돼지품종들과 정자의 HSP70 유전자형에 따른 2-cell 단계까지의 체외수정란 배발달은 유의적 차이를 보였다. Landrace(28.8)와 Duroc(29.8)에서 2세포기까지 발달된 수정란의 수는 Yo.kshire(10.9) 보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 또한 HSP70 K4-AB(29.6)형의 2세포기 단계까지의 배발달 수정란 수는 HSP70 K4-AA(10.6)형보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 그러나 돼지 품종 및 HSP70 유전자형에 따른 배반포기까지 수정란 배발달 정도는 유의적 차이는 없었다. 이러한 결과들은 돼지 체외수정란의 초기 배발달은 HSP70 유전자형과 품종에 따라서 영향을 받는 것으로 확인되었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제16권3호
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• pp.213-221
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• 2001

본 연구는 복제 돼지의 생산성 향상과 형질전환에 의한 대체상기용 복제 돼지 생산에 기여하기위한 기초연구로 공여세포의 조건, 핵이식 수정란의 융합 및 활성화와 체외발달에 미치는 각종 요인들은 조사하였다. 공여세포는 생후 10개월 된 Landrace 종으로부터 귀 세포조직(5$\times$5mm)을 채취하여 0.05%의 trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리하여 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액으로 계대배양을 실시하여 사용하였다. 핵이식은 laser system 으로 투명대를 drilling하여 수핵난자의 극체와 핵을 제거한 후 공여세포를 주입하였으며. 핵이식란은 DC 1.9kv/cm, 30$\mu$sec 1회의 전기자극으로 융합과 1시간 후 AC 1.50kv/cm, 30$\mu$sec 1회의 조건으로 활성화를 실시하여 분할을 유도하였다. 분할된 핵이식 수정란은 10% FBS가 첨가된 NCSU-23 배양액으로 $CO_2$배양기에서 6~8일 동안 체외배양을 실시하여 배반포기로 발달한 수정란을 Hoechst 33342로 핵염색을 하여 할구수를 조사하였다. 공여세포의 기아배양을 3~4 및 5~6 일간 실시하여 핵이식 후 전기자극으로 융합을실시하였을 때 융합율은 각각 45.6 및 36.8%로써 기아배양 기간에 따른 차이는 없었다. 융합 및 활성화가 유기된 핵이식란의 분할율은 3~4일간 기아배양을 실시한 공여세포가 67.1%로써 가장 높았으며(P<0.05), 5~6일간 기아배양을 실시한 공여세포의 57.1%와는 차이가 없었다. 공여세포를 1~2, 5~6 및 13~14대 계대배양한 것을 사용한 핵이식란의 융합율은 각각 52.7, 53.0 및 51.7%로써 차이가 없었다. 융합이 이루진 핵이식란을 활성화를 유도했을 때 1~2, 5~6 및 13~14대 계대배양한 공여세포의 분할율도 각각 42.7, 46.8 및 45.5%로써 차이가 없었다. 25$\mu$m$\geq$ 크기의 공여세포를 사용하였을 때 핵이식란의 융합율은 65.3%로써 25~30$\mu$m 및 30$\mu$m $\leq$ 크기 공여세포의 융합율 42.5 및 45.5% 보다는 유의적(P<0.05)으로 높았다. 융합과 활성화가 유기된 핵이식란의 분할율은 25$\mu$m $\geq$, 25~3o$\mu$m 및 30$\mu$m $\leq$ 크기에서 각각 56.5, 68.8 및 58.5%로써 공여세포의 크기에 따른 분할율은 유의적인 차이가 없었다. 체외수정란과 체세포 핵이식 수정란의 발달에 있어서는 분할율이 각각 80.1%와 64.0%로써 핵이식 수정란이 체외수정란 보다 낮았으나, 배반포기로의 발달율에 있어서는 각각 12.4%와 10.5%로써 차이가 없었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권1호
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• pp.19-25
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• 2004

본 연구는 돼지 체외수정란의 생산에 있어서 체외배양체계를 확립하기 위해 정액의 차이와 보관시간에 따른 체외성숙난자의 체외수정 및 체외발달율을 조사하였고, NCSU23와 G1.3/G2.3 배양액으로 체외배양 시 분할율과 체외발달율을 조사하였고, 체외배양액에 GSH를 첨가 시 배발달율을 조사하였다. 본 연구에서 얻은 결과는 다음과 같다. 1. 액상정액과 동결정액을 사용하여 정액에 따른 체외수정율은 각각 46.2 및 39.7%로써 액상정액을 이용한 것이 수정율이 높았지만 유의적(P<0.05)인 차이는 없었다. 한편 배반포로의 발달율은 액상정액이 동결정액보다 유의적으로 높았다.(P< 0.05) 2. 정소상체미부 정액을 day 1, 2, 3 보관후 체외수정을 유도하였을 때 수정율은 각각 60.5, 61.0 및 56.8%로서 2일 동안 보관후 사용하였을 때가 높았지만 유의적(P<0.05)인 차이가 없었다. 또한 상실배와 배반포기까지의 배발달율에서도 2일 동안 보관 후 사용하였을 때가 높았지만 유의적(P<0.05)인 차이는 없었다. 3. NCSU-23와 G1.3/G2.3으로 나눠 배양 시 분할율과 상실배기까지의 배발달율은 각각 52.8, 62.1%와 16.0, 28.9%로서 G1.3/G2.3에서 유의적(P<0.05)인 차이로 높았다. 그러나 배반포기로의 배발달율을 각각 11.6와 4.7%로서 NCSU-23에서 유의적으로 높았다.(P<0.05) 4. NCSU-23을 기본 배양액으로 하여 1 mM GSH가 첨가된 군의 분할율은 62.3%로서 GSH가 첨가되지 않은 군 53.5%보다 유의적(P<0.05)인 차로 높았지만, 상실배나 배반포기까지의 배발달율은 GSH가 첨가되지 않은 군보다 높았지만 유의적(P<0.05)인 차는 존재하지 않았다.ne을 처리하는 것이 수태율을 향상시키는 것으로 나타났다.25^{\circ}C$에서 발현되었고 이 중 79.1%가 3일령, 4일령과 5일령에 집중적으로 나타났다. 계분의 경우 $25^{\circ}C$ 처리구에서 35.12%(56.95mg/kg), $37^{\circ}C$에서 45.89%(74.40mg/kg)로 나타나 주로 $25^{\circ}C$ 이상에서 발현한 것으로 특징지어졌다. 우분의 경우 $10^{\circ}C$ 처리구에서 28.21%(43.86mg/kg), $25^{\circ}C$에서 49.30% (76.66mg/kg)로 나타나 주로 $25^{\circ}C$ 이하에서 발현한 것으로 나타났다. 3. 배양온도에서 검지 된 뷰틸산의 량은 6일 동안 돈분에서 1,463.87mg/kg, 계분에서 96.72mg/kg, 우분에서 129.18mg/kg이 발현되었으며 돈분의 경우 93.31%(1,365.95mg/kg)가 $25^{\circ}C$에서 발현되었고 이 중 87.92%가 3일령, 4일령과 6일령에 집중적으로 나타났다. 계분의 경우 $37^{\circ}C$ 처리구에서 76.60%(74.09 mg/kg)로 발현되었고 이 중 88%가 1일령, 2일령과 5일령에 집중적으로 나타났다. 우분의 경우 61.55%(79.51mg/kg)가 $25^{\circ}C$에서 발현되었고 이 중 89.6%가 1일령, 3일령과 4일령에 집중적으로 나타났다. 4. 배양온도에서 검지된 이소밸릭산의 량은 6일 동안 돈분에서 6,885.99mg/kg, 계분에서 307.47mg/kg,

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권3호
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• pp.201-208
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• 2004

본 연구에서는 clonal cell lines을 효율적으로 확립할 수 있는 방법을 제시하기 위하여 배양액 내에 catalase와 $\beta$ME 첨가가 clonal cell line 확립 효율에 미치는 영향을 검토하였다. 임신 50일령의 암퇘지에서 얻은 태아섬유아세포를 2회 passage한 후 동결 보관하였다가 실험에 이용하였다. 단일세포를 catalase나 $\beta$ME가 첨가된 배양액이 들어 있는 96-well dish로 옮겨 배양하였다. 단층이 형성된 세포는 4-well dish로 옮겨주어 배양하였으며, 이후 2회 이상 passage가 가능한 세포를 clonal line이 확립된 세포로 판정하였다. 실험 1에서 clonal line 확립효율에 미치는 catalase와 $\beta$ME의 효과를 검토하기 위하여 세포를 100ng/$m\ell$) catalase와 100nM $\beta$ME가 첨가된 DMEM액 내에서 배양하여 clonal line 확립효율을 검토하였다. $\beta$ME 첨가 시 clonal line 확립효율이 8.3%로 대조구의 3.2%에 비해 유의적으로 높게 나타났다.(P<.0.05). 그러나 catalase 첨가 시(3.6%)에는 대조구와 차이가 없었다. 실험 2에서 catalase 농도(0, 10, 100, 1,000ng/$m\ell$)에 따른 clonal line 확립효율을 검토하였다. 대조구에 비하여 모든 처리구에서 clonal line 확립 효율에 대한 첨가효과가 없었다(0-2.6%). 실험 3에서 $\beta$ME 농도(0, 10, 100, 1,000 nM)에 따른 clonal line 확립효율을 검토하였다. 100 nM의 $\beta$ME 첨가 시 clonal line 확립 효율이 9.4%로 대조구 및 타 처리구(0-l.6%)보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 본 연구 결과 배양액 내 catalase 첨가는 확립효율에 영향을 미치지 않지만, 100nM의 $\beta$ME 첨가로 clonal cell line의 확립효율을 향상시킬 수 있는 것으로 나타났다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제20권2호
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• pp.129-135
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• 2005

본 연구는 돼지 수정란의 동결에 있어서 vitrification 동결 융해 후 내동제의 종류완 농도, PVP 및 sucrse와 trehalose의 첨가가 생존율에 미치는 영향을 조사하고자 수행하였다. 1 Vitrification동결에 이용된 각 발생단계의 체외수정란은 1,063개 중 2세포기는 245$(23.0\%)$개, 배반포는 $256(24.1\%)$, 초기 배반포는 $234 (22.0\%)$, 확장 배반포는 221개 $(20.8\%)$, hatching 배반포는 107개 $(10.1\%)$이었다. 상실배, 초기 배반포 및 확장배반포를 EDS와 ETS로 희석 후 vitrification동결 융해했을 때 생존율은 각각 $69.1\%,\;70.3\%,\;69.8\%$ 및 $62.5\%,\;61.7\%,\;63.6\%$로서 EDS군에서 확장 배반포군에서 가장 높은 생존율을 나타냈다. 2. 각 발생단계의 수정란을 vitrification동결 융해했을 때 생존율은 초기 배반포는 $61.1\%$, 확장 배 반포는 $27.8\%$, hatching 배 반포는 $16.7\%$로서 대조군의 $92.3\%,\;71.2\%,\;55.8\%$에 비해 낮았지만 높은 생존율을 나타냈다. 3. 수정란을 EDS와 EDT내동제에 $10\%$ 및 $20\%$ PVP 액을 첨가하석 희석 후 vitrification 동결 융해했을 때 정상적 발생을 나타내는 수정란은 $74.3\%,\;77.5\%$ 및 $79.4\%$ 및 $71.1\%$였다. 동결 융해한 수정란을 $24\~48$시간 배양했을 때 $37.1\%,\;40.0\%$ 및 $35.3\%,\;31.6\%$로서 생존율이 현저하게 감소하였다. 수정란에 EDS와 EDT와 $10\%$ 및 $20\%$의 PVP를 첨가한 내동제를 이용하여 동결 응해했을 때 PVP농도간의 생존율은 유의한 차이가 없었다. 4. 각 발생단계의 수정란을 EDS 내동제로 vitrification 동결 융해 후 배양했을 때 발생율은 상실배는 $58.2\%,\;36.4\%,\;14.5\%$였고, 초기 배반포는 $62.5\%,\;45.8\%,\;20.8\%$였고, 확장 배반포는 $74.1\%,\;61.1\%,\;29.6\%$였고, hatching 배반포는 $60.0\%,\;40.0\%,\;14.0\%$였다.

• 농업과학연구
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• 제26권2호
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• pp.19-24
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• 1999

본 실험은 배지 및 호르몬이 돼지 난포란의 체외성숙 및 체외발생능에 미치는 영향을 구명하기 위하여 실시하였다. 기본 배지는 TCM-199, Waymouth MB751/1 및 BMOC-II를 사용하였으며, 각각의 배지에 첨가된 호르몬은 hCG와 FSH를 사용하였다. 실험에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. TCM-199을 기본배양액으로 하여 돼지난포란을 체외배양하였을 때, 체외성숙률은 배양액내에 hCG 단독첨가의 경우가 78.05%, FSH 단독첨가에서 72.50%, hCG와 FSH의 병용첨가의 경우가 67.50%로서 호르몬을 첨가하지 않은 처리구의 54.29%에 비하여 유의적(P<0.05)으로 높은 성적을 나타냈으며, 수정후 같은 배지조건하에서 난할률은 호르몬 첨가의 경우(hCG 46.88%, FSH 31.04%, hCG+FSH 37.04%)가 무첨가구(89.47%)에 비하여 유의적(P<0.05)으로 낮았다. 2. Waymouth MB751/1을 배양액으로 하여 체외배양하였을 때, 체외성숙률은 배양액내에 hCG가 71.43%, hCG+FSH 병용첨가의 경우가 80.00%로서 호르몬을 첨가하지 않은 처리구의 25.64%에 비하여 유의적(P<0.05)으로 높은 성적을 나타냈다. 그러나, 난할률은 호르몬 첨가의 경우(hCG 46.67%, FSH 36.00%, hCG+FSH 35.71%)가 무첨가구(60.00%)에 비하여 낮은 성적을 나타냈다. 3. BMOC-II를 기본배양액으로 하여 체외배양 하였을 때, 체외성숙률은 배양액내에 hCG 단독첨가 66.7%, FSH 단독첨가 91.89%, hCG+FSH 병용첨가 81.82% 및 무첨가구 66.67%로 각각 나타나서 FSH 단독첨가의 경우가 가장 높은 성적을 나타냈다. 또한, 난할률은 hCG 단독첨가 79.17%, FSH 단독첨가 50.00%, hCG_FSH 병용첨가 66.67% 및 무첨가 81.82%로 각각 나타났다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제18권1호
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• pp.1-14
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• 2003

본 연구는 미성숙, 성숙 단계의 돼지 난포란이 유리화 동결에 의한 동결보존이 가능한지를 조사 하고자 실시하였다. 난포란은 세포질 내 지방구를 분극시키기 위해 원심분리를 실시하였고, 미세조작기를 이용하여 지방구를 제거하였다. 돼지 난포란을 CB 처리하여 원심분리 후 지방구를 제거한 지방제거구(Delipated), CB 처리 후 원심분리만 하여 지방구를 분극시킨 원심분리구(Centrifuged), 아무처리도 하지 않은 대조구(Control)를 EM grid를 이용한 유리화 동결, 융해 한 후 생존율과 체 외 발생율을 조사하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 미성숙 시기에 지방제거, 원심분리, 무처리 후 유리화 동결을 실시한 돼지 난포란의 생존율은 각각 15.1%, 0%, 0%로 지 방제 거구에서만 유의적으로 높은 생존율을 나타내었다(p<.01). 2. 성숙 시기에 지방제거, 원심분리, 무처리 후 유리화 동결을 실시한 돼지 난포란의 생존율은 각각 12.2%, 0%, 0%로 지방제거구에서만 유의적으로 높은 생존율을 나타내었다(P<.01). 3. 미성숙 시기에 지방제거 후 유리화 동결을 실시하여 생존한 난자치 핵 성숙율은 37.5%로 동결하지 않은 난포란의 성숙율 68.9%보다 유의적으로 낮은 것이었다(P<.01). 4. 미성숙 시기에 지방제거, 원심분리, 무처리 후 유리화 동결을 실시하여 생존한 난자의수정 후 배 발달율은 12.5%, 0%, 0%로 지방 제거구에서만 배 발달을 나타었으나, 세 처리간의 유의차는 없었고, 이것은 동결하지 않은 난포란의 배 발달율 56.1%보다는 유의 적으로 낮은 것이었다(P<.05). 5. 성숙 시기에 지방제거, 원심분리, 무처리 후 유리화 동결을 실시하여 생존한 난자의 수정 후 배 발달율은 25.0%, 0%, 0%로 지방제거구에서만 배 발달을 나타내었으나 세 처리간의 유의차는 없었고, 이것은 동결하지 않은 난포란의 배 발달율 67.9%보다는 유의적으로 낮은 것이었다(P<.05).

• 한국가축번식학회지
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• 제26권3호
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• pp.235-243
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• 2002

본 연구는 몇 몇 포유류로부터 얻은 공여세포핵의 proliferation을 돕기 위한 수핵난자로 소 난자의 세포질을 사용하였으며, 공통 세포질로써의 능력을 시험하였다. 소 난자와 소, 사람, 돼지, 생쥐의 체세포와의 결합에서 유래한 각 종별 핵이식란의 융합율, 분할율, 배발달률 그리고 염색체 수를 조사하였다. 1. 소, 돼지, 생쥐, 사람 각각의 체세포를 이용한 핵이식란의 융합율은 70.2% 70.2% 72.4%와 63.0 %로 유의차를 보이지 않았다. 2. 소, 돼지, 생쥐, 사람 각각의 체세포를 이용한 핵이식란의 체외분할 ($\geq$2cell cleavage)율 또한 60.6%, 63.7%, 54.1%와 62.7%로 유의차가 없었다. 3. 각 종별로 체외분할이 일어난 시기를 조사한 결과 종에 관계없이 대체로 활성화 처리 후 24시간째에 대부분 일어나는 것을 볼 수 있었다. 그러나 점차적으로 분할이 계속 이루어지면서 발달시기가 종 특이적인 특성을 나타내는 것을 볼 수 있었다. 4. 이종간 핵이식의 후기 배발달 (상실배와 배반포) 률을 살펴보면 소와 사람의 체세포를 사용했을 경우 17.5%, 4.3%의 결과를 나타내었으며, 돼지와 생쥐의 체세포를 사용한 경우 16세 포기 이후 단계에 발달중지 현상을 볼 수 있었다. 5. 4~8 세포기 정도의 각 종별 핵이식란 할구를 분석에 사용하였을 때, 공여핵으로 사용된 종의 염색체 수와 일치하는 결과를 볼 수 있었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 성숙한 소 난자의 세포질은 소뿐만 아니라 돼지, 생쥐, 사람과 같은 다양한 포유류의 핵을 사용하여 핵이식을 하였을 때에도 발달이 가능하다는 것을 보여주고 있다.