• Journal of Plant Biotechnology
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• 제35권4호
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• pp.275-280
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• 2008

Agrobacterium공동배양법으로 오이의 기관발생을 통한 형질전환에서 가장 문제점 중 하나는 chimeric 형질전환체의 발생빈도이다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 항생제로서 paromomycin이 첨가된 선발배지에서 "은성" 품종의 배축절편으로부터 체세포배발생을 통한 형질전환시스템을 개발하였다. 배축절편을 pPPTN290발현벡터가 도입된 Agrobacterium 균주 (EHA101)에 30분간 접종한 후 2일간 공동배양 하였고, 선발배지에서 2주 간격으로 5회 계대 배양하면서 항생제 저항성 캘러스 선발, 체세포배발생 및 식물체를 유도하였다. pPPTN290발현벡터의 T-DNA는 reporter유전자로서 Ubi 프로모터에 의해 gus유전자가 발현조절 되도록 그리고 항생제로서 paromomycin에 저항성을 갖는 nptII유전자가 35S 프로모터에 의해 발현되도록 제조하였다. 안정적 형질전환과 빈도는 캘러스의 paromomycin항생제 저항성과 GUS유전자의 발현 여부에 의해 조사하였다. Agrobacterium과 공동배양한 928개의 배축절편에서 paromomycin에 저항성을 갖는 56개의 캘러스 클론을 얻었고, 이중 48개 캘러스 클론 (5.2%)에서 GUS유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 확인하였다. 48개의 캘러스 클론중에서 오직 5개의 캘러스 클론으로부터 식물체를 얻어 낮은 빈도 (0.5%)를 나타냈다. 수확한 $T_1$종자에서 GUS양성반응은 gus유전자가 오이 게놈에 안정적으로 도입 및 발현되고 있음을 확인하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제33권1호
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• pp.27-32
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• 2006

파인애플 (Ananas comosus) 줄기에서 얻어지는 bromelain은 단백질 분해효소 중 cysteine protease의 복합체로 알려져 있다. 본 연구에서는 제주산 파인애플 줄기를 이용하여 bromelain 관련 유전자를 분리하였다. 분리된 BL1 유전자는 총 933개의 염기서열로 311개의 아미노산을 coding 하였다. 지금 까지 알려진 식물 유래 bromelain 관련 유전자와의 alignment 분석한 결과 BAA21929 유전자와 94%, T10516 유전자와 93% 및 P14518 유전자와 81%의 상동성을 보였다. BL1 유전자를 상추 게놈내에 도입하고자 NPTII 유전자 와 BL1 유전자로 제작한 pBI 121 BL 벡터를 Agrobacterium tumefacience LBA4404에 도입한 후, 상추잎 절편에 감염시켜 embryogenic callus 및 재분화 식물체를 육성하였다. 이들식물체로부터 T1세대를 육성하여 PCR 분석을 통해 왜래유전자의 도입 여부를 확인하였다. 또한 형질전환체의 발현여부는 Nothern blot분석 및 eno protease활성을 통해 형질전환체에서 BL1유전자가 안정적으로 상추세포내에서 발현되고 있음을 확인하였다. 따라서 본 실험에서 육성된 bromelain 관련 BL1 유전자가 도입한 형질전환 상추를 육종소재르 활용한다면 상업적으로 유용한 단백질을 분해하는 가수분해효소로써 건강 보조제, 사료첨가제 등에 널리 사용할 수 있을 것으로 생각되어진다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제32권4호
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• pp.257-262
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• 2005

Agrobacterium과 자엽절 공동배양으로 대두 형질전환체를 생산하였다. 멜론 (슈피VIP품종)의 자엽절 절편은 선발 마커로서 bar와 reporter로서 gus유전자가 포함된 pPTN289 또는 선발마커로서 nptII유전자와 reporter로서 gus유전자로 제작된 pPTN290벡터를 LBA4401, GV3101, EHA101에 각각 형질전환하여 공동 배양하였다. 최대 형질전환빈도(0.16%)는 EHA101 (pPTN289)균주로 공동배양한 자엽절 절편을 glufosinate가 첨가된 선발배지에서 얻을 수 있었으며, 최종적으로 glufosinate저항성과 잎 ($T_0$), 화기 ($T_0$), 종자 ($T_1$) 및 유식물체 ($T_1$)에서 GUS양성반응을 나타내는 5개체를 얻었다. Southern분석에 의하여 GUS유전자가 멜론 genomic DNA에 도입되어 있음을 확인하였다.

• 식물조직배양학회지
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• 제26권4호
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• pp.281-287
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• 1999

본 연구에서는 제초제 저항성 더덕을 개발하고자 하여 제초제 저항성 bar유전자의 형질전환을 수행하였고, 더덕 종자 발아 생리, 체세포배 유도 및 선별배지 농도 등에 대해 조사하였다. 기내종자발아는 GA$_3$를 첨가한 MS배지에 치상하여 15$^{\circ}C$에서 배양하였을 때 광, 암 두 조건 모두에서 90%의 발아율을 나타내었다. 식물체 재분화는 체세포 배발생 경로를 통하여 이루어 졌다. 배발생 캘러스는 자엽, 줄기,잎을 2,4-D와 Zeatin을 혼용처리하여 유도할 수 있었다. Basta와 PPT는 10mg/L 이상의 농도에서 식물체가 갈변고사 하였다. Explant는 l00mg/L 이상의 kanamycin에서 캘러스를 형성하지 못하였다. Explant를 제초제 저항성 bar유전자의 식물 형질전환 벡터를 포함하는 Agrobacterium tumefaciens LBA4404과 2일간 공존 배양한 후, 100mg/L kanamycin, 500mg/L carbenicillin과 1.0mg/L 2,4-D이 포함된 배지에서 형질전환체를 선발하였고, 계대배양으로 배발생 캘러스를 유도하고 체세포배를 얻었다. 체세포배를 200 mg/L kanamycin,500mg/L carbenicillin이 포함된 N6배지에 치상하여 발아시켰다. PCR 수행결과 NPTII와 bar유전자가 증폭되어 나타남으로서 도입된 유전자가 잠정적인 형질전환체 내에 존재함을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 얻어진 bur유전자 형질전환 식물체는 RNA및 단백질 수준에서의 발현 여부 검정을 거친 후, 제초제 저항성 더덕 생산 및 제초제 저항성 유전자의 후대 유전 양상 분석을 위한 기초 자료로 이용될 수 있을 것이다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제35권1호
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• pp.55-61
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• 2008

PCR 및 Real-Time PCR 검정으로 확인된 국화 형질전환체는 저온저항성 BN115 gene과 표지유전자로 kanamycin에 저항성 있는 nptII gene을 가지고 있는 식물발현용 binary vector pBin19/BN115가 삽입된 A. tumefacience MP90을 국화잎에 공동 배양함으로 유전자가 도입되었다. 최종 선발된 형질전환체의 온도별 생육은 형질전환체가 비형질전환체에 비해 초장, 생체중, 엽수 모두 우수하였다. 또한 저온에서의 상해정도 관찰에서도 수침상정도가 비형질전환체보다 경미하였다. 저온의 외부환경에 따른 국화잎의 기공모양은 닫고 있는 비형질전환체와 달리 형질전환체는 개구된 모양을 유지하고 있었으며, 크기는 형질전환체의 크기가 비형질전환체보다 더 큰 것으로 측정되었다. 저온조건에서의 형질전환체 엽록소 함량은 5, $25^{\circ}C$에서는 비형질전환체와 비교하여 SPAD value 값에 큰 차이가 없었지만, 10, $15^{\circ}C$에서는 최대 +5.7 (평균+3.0), +9.7 (평균 +5.7)로 상대적으로 높은 함량을 나타냈다 또한 Ion leakage test결과 저온저항성 유전자가 도입된 형질전환체의 세포가 외부환경에 안정적으로 적응하여 세포내 파괴나 상해를 받지 않음으로 형질전환체의 EC 농도 (ds/m)가 비형질전환체에 비해 $1.29{\sim}1.97$배 낮은 수치를 보였다.

• 식물조직배양학회지
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• 제26권3호
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• pp.163-169
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• 1999

우리나라의 주요 개량 포플러의 하나인 현사시 3호를 대상으로 Arobacterium tumefaciens MP 90/PAT을 이용하여 비선택성 제초제인 Basta에 내성을 갖는 형질전환체를 획득하고자 본 실험을 수행하였다. 기내 배양된 엽절편을 재료로 균주에 10분간 감염, 2일간 공조 배양 및 3주간 선발배지에서 배양으로 kanamycin에 내성을 갖는 잠정적인 형질전환 캘러스를 유도하였다. 선발된 캘러스로부터 배양 4주 후 줄기를 유도하였으며, 증식된 줄기는 발근시켜 완전한 형질전환체를 얻었다. 형질전환체는 PCR기법 및 Southern blot 분석으로 PAT 유전자 전이를 확인하고. 유전자의 발현은 GUS 유전자의 발색 반응으로 확인하였다. 형질전환체는 폿트로 이식하여 4주간 생장시킨 후 제초제 Basta로 살포한 결과 대조구 식물체는 고사되었으나, 형질전환체는 정상적인 생육이 가능하였다

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제34권4호
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• pp.375-380
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• 2007

국내 옥수수 순계주에서 Agrobacterium 공동배양으로 CP4 5-Enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (CP4 EPSPS) 유전자가 도입된 제초제저항성식물체를 개발하였다. 5개의 순계주 (HW1, KL103, HW3, HW4, HW7)의 미숙배를 Ubiquitin promoter-CP4 EPSPS 유전자와 CaMV35S promoter-nptII 유전자가 발현되도록 제조된 pCAMBIA2300 벡터를 C58C1 Agrobacterium에 형질전환하여 공동 배양하였다. 항생제로 paromomycin이 첨가된 배지에서 선발된 옥수수 형질전환체를 PCR, RT-PCR 및 Northern 분석을 통하여 유전자의 도입과 발현을 확인하였다. 또한 형질전환 식물체의 glyphosate 처리에 따른 shikimate 축적반응을 확인하였다. Paromomycin 저항성 캘러스 형성빈도는 옥수수 각 순계주 HW1, KL103, HW3, HW4, HW7에서 각각 0.37%, 0.03%, 2.20%, 2.37%, 0.81%로 나타났으며, PCR분석을 통하여 최종적으로 2개의 옥수수 순계주 (HW3, HW4)의 paromomycin 저항성 캘러스로부터 분화된 식물체에서 확인하였다. 이러한 형질전환체중에서 RT-PCR 및 Nothern blot 분석을 통하여 CP4 EPSPS 유전자가 발현되는 2개의 계통 (M266, M104) 을 선발하였고, shikimate 축적반응을 통하여 glyphosate에 대한 저항성을 갖는 계통 (M266)을 최종적으로 선발하였다. 이러한 결과는 국내 옥수수 순계주에서 제초제저항성을 갖는 옥수수 형질 전환체를 개발할 수 있음을 시사한다.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권3호
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• pp.207-217
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• 1998

한국에서 자생한 자연산 tumor 조직과 근권토양으로부터 형질전환율이 높은 hypervirulent Agrobacterium spp를 분리하기 위해서 Salix, Diospyros, Populus 및 Malus에서 형성된 tumor 조직과 근권토양을 채취하괴 Schroth 선택배지와 New and Kerr 배지를 이용하여 78 균주의 colony를 특성에 따라 분리하였다. 이중에서 48 균주가 당근 disc에서 tumor를 형성하였으며 tumor를 형성한 균주중 형성시기가 빠르며 크기가 커 hypervirulent 균주로 생각되는 A. tumefaciens SP101을 biotype 1, 그리고 A. tumefaciens SM042를 biotype 2로 동정하였다. 토양중에서 선발한 A. tumefaciens SM042와 disarmed A. tumefaciens PC2760에 kanamycin 저항성 유전자를 함유하고 있는 binary vector pGA643을 도입하여 conjugant인 A. tumefaciens SM643과 A. tumefaciens PC643을 kanamycin과 tetracycline이 함유된 최소배지에서 획득하였다. 연초의 형질전환을 위해서 conjugant Agrobacterium과 연초조직을 동시배양 후 2,4-D와 kanamycin이 함유된 선발배지에 치상하여 형질전환을 유도한 결과 A. tumefaciens SM643이 A. tumefaciens PC643보다 더 많은 캘러스가 형성되었다. 그러나 A. tumefaciens PC643을 사용한 형질전환 캘러스는 대부분 friable한 캘러스로 유도되었으며 정상적으로 식물체로 생장하였으나 A. tumefaciens SM643을 사용한 캘러스는 매우 딱딱하며 둥그런 형태의 캘러스와 friable한 캘러스가 혼재한 상태로 생장하였으며, 이중에서 friable한 캘러스는 정상적인 shoot가 형성되었으나 딱딱한 캘러스로 유도된 형질전환체는 식물체로 형성되지 않고 반구형 미색의 전형적인 tumor 캘러스로 생장하였다. 한편 형질전환시 캘러스를 유도하지 않고 직접 shoot를 형성시킨 결과 disarmed Ti-plasmid를 사용하지 않고 wild-type Ti-plasmid를 사용해도 정상적인 형질전환체를 획득할 수 있었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제35권4호
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• pp.299-306
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• 2008

선발마커로 두 종류의 항생제 (hpt와 nptII)와 제초제(bar) 유전자를 사용하여 아그로박테리움을 이용한 수정된 들깨 형질전환방법을 개발하였다. 들깨 배축 절편을 pMOG6-Bar 운반체 혹은 pCK-Bar 운반체를 가진 아그로박테리움 EHA 105와 각각 3일간 공동배양 하였다. 1차로 형성된 신초는 하이그로마이신(15mg/L)이나 카나마이신(125 mg/L)을 사용하여 선발하였고 재분화 된 신초들은 확실한 형질전환체를 얻기 위해서 포스피노트리신(1.2 mg/L)에서 한번 더 선발하였다. 뿌리는 호르몬이 없는 MS배지에서 재분화 신초로 부터 유도하였으며 80개의 재분화개체를 획득하였다. 들깨 지놈으로 형질전환유전자의 삽입은 서던 블럿으로 확인하였고 유전자의 발현은 노던 블럿으로 분석하였다. To 식물체로부터 유도된 T1들깨 종자들은 후대로의 안정된 유전자 전이를 확인하기 위하여 0.3% 바스타 제초제 살포로 확인하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제34권1호
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• pp.37-45
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• 2007

수박은 형질전환이 매우 어렵고 직접적인 신초 유도방법으로는 안정된 형질전환을 기대할 수 없어서, 다른 여러 작물에서 높은 효율을 보였던 캘러스 유래 신초 유도 방법을 도입하고자 하였다. 수박의 최적 캘러스 유도조건은 자엽 절편체의 경우 2.0 mg/L zeatin과 0.1 mg/L IAA이었으며 뿌리 절편체의 경우 2.0 mg/L BA와 0.1 mg/L 2,4-D이었다. NptII 유전자의 선발 항생제는 kanamycin보다는 paromomycin 빠르고 효과적이었으며, 수박의 절편체에 Agrobacterium을 접종 한 후 paromomycin을 125 mg/L 첨가한 배지에서 선발하였다. pmGFP5-ER vector로 형질전환한 후 캘러스 상태에서 형광현미경을 통해 GFP 유전자의 도입을 확인하였으며, 딱딱한 초록색의 캘러스에서 강한 GFP 발현을 관찰하였고, 자엽유래 캘러스의 경우 WM8에서 9.0%, 뿌리유래 캘러스의 경우 WM6에서 8.3%의 가장 높은 GFP 발현 효율을 보였다. GFP 유전자 도입과 같은 방법으로 WMV-CP 유전자가 있는 pWMV2300 vector로 형질전환한 후 캘러스 상태에서 PCR 및 Southern blot 분석을 한 결과, 두 점의 캘러스에서 WMV-CP 유전자가 도입되었음을 확인하였다. 본 연구를 통하여 확립된 수박의 캘러스 유도 시스템은 안정된 수박 형질전환 방법에 기초 자료로서 이용될 것이다.