미생물에서 추출된 lipase를 유지방분해에 이용하기 위한 기초연구로서 Rhizopus delemar, Mucor sp. 및 Candida cylindracea에서 추출된 3중의 lipases를 유지방분해에 적합한 반응조건을 설정하고, 이들의 반응 특이성을 연구한 결과는 다음과 같다. 최적온도 및 최적pH는 Rhizopus delemar lipases가 $45^{\circ}C$, pH5.6 Mucor sp. lipases가 $35^{\circ}C$, pH7.5였으며, Candida cylindracea lipase는 $35^{\circ}C$, pH 7.0 이었다. 유지방에 대한 적정효소농도는 3종의 lipase 모두 $600{\sim}800\;units/ml$였다. 적정기질농도는 효소의 종류에 관계없이 유지방함량 20%였으며, 이들의 Km값은 R. delemar lipase가 6.06%, M sp. lipase가 7.69%, Can. cylindracea lipase가 7.99%였다. 반응시간에 따른 반응율을 조사한 결과 R. delemar lipase, M. sp. lipase, Can. cylindracea lipase순으로 높았으며 반응시간이 진행됨에 따라 저급지방산의 분해율이 높아졌으며, 반응 8시간에서는 R. delemar lipase는 butylic acid, M. sp. lipase는 palmitic acid, Can. cylindracea lipase는 Capric acid의 함량이 높았다.
${\gamma}-linolenic$ acid를 함유한 유지를 생산하기 위해 포도당을 주기적으로 첨가하면서 Mucor sp. KCTC 8405P를 유가배양하였다. 배양 시작 후 2일까지 효모 모양으로 배양한 후 배지의 pH를 높여 균사체 모양으로 유도하여 배양하면, 지방질은 포도당이 고갈되는 배양 7일째까지 축적되었다. 본 배양조건에 의하여 건조 균체량 99.3 g/l, 총지방질 38.0 g/l와 3.5 g/l의 ${\gamma}-linolenic$ acid를 얻을 수가 있었다.
In order to produce ${\gamma}-linolenic$ acid by Mucor sp. KCTC 8405P. the fungus was cultivated in fed-batch culture with two phases. i.e., growth in yeast-like form and induction to hyphal growth by pH shift of the culture medium during cultivation. The synchronous growth of the fungus into the appropriate sizes was important for the high density cell culture of this dimorphic fungus. Dissolved oxygen concentration in the medium did not affect degree of unsaturation of fatty acids and ${\gamma}-linolenic$ acid content. Under the culture conditions applied in this experiment. the fungus was found to produce 100 g/l dry mycelia containing 40% of the lipids, where ${\gamma}-linolenic$ acid comprised about 9% of the total extractable fatty acids.
For a studyon the production of ${\gamma}$-linolenic acid(GLA) by fungi 3 fungal strains were isolated from soil. Their cell growth lipid content and fatty acid composition were compared in shake flask culture. Among these fungi the fungus designated as FA-007 has high lipid content(21.1%) and GLA content(15.6% of total fatty acids) The fungal strain FA-007 was tentatively identified as Mucor sp. on the basis of morphological characteristics, Fungal oil produced by this fungus was composed of 75.2% neutral lipid 5.3% glycolipid and 19.5% phospholipid. Although the GLA content in phospholipid was higher than it in neutral lipid the GLA content in neurtal lipid was high as 15.5%.
가스크로마토그라프와 질량분석기 (GC-MS)를 이용하여 감마리놀렌산(GLA) 생산 균주를 선발하였다. KACC에 보존 중인 Phytophthora 속, Pythium 속 및 Mucor 속 및 Rhizopus 속 등 4속에 속하는 44개 균주를 GC-FID를 통하여 GLA를 분석하였다. 4속 39종의 곰팡이 균주에서 GLA를 확인하였으며, M. hiemalis f. sp. hiemalis KACC 40264 균주에서는 GLA의 조성비가 전체 지방산의 24.8%로서 가장 높은 비율을 나타냈다. 속간에 전체적인 GLA 함량은 Mucor 속(14.2%)과 Rhizopus 속(14.3%)의 Zygomycota가 상대적으로 높은 함량을, 그리고 Phytophthora 속(3.3%)과 Pythium 속(3.0%)의 Oomycota는 낮은 함량을 나타냄으로서 뚜렷한 양분현상을 나타냈다. 지방산총량에서도 Mucor 속(15.4 mg/100 ml)과 Rhizopus 속(7.1 mg/100 ml)가 Phytophthora 속(2.6 mg/100 ml)와 Pythium 속(4.5 mg/100 ml)보다 높게 나타나서 전체적으로 지방산을 생산하는 유용한 균류자원으로 평가되었다. Mucor 속 내에서도 계통별로 큰 차이를 나타냈는데 18.2%의 GLA를 생성함으로 지방산총량이 50.8 mg/100 ml까지 이른 Mucor blumbeus KACC 40935가 실제적으로 가장 활력이 좋은 균주로 평가되었다.
감마-리놀렌산 생산을 목적으로 균주 보관소에서 구입한 Mucorales목 15균주와 실험실에서 분리한 사상균 10균주의 균체성장, 지질생성량, 감마-리놀렌산 함량 및 펠렛 크기등을 비교 조사하였다. 조사한 균주중 토양에서 분리한 FB-354균주가 진탕배양시 균체성장이 양호하고, 지질함량이 건조균체중 29.9%, 감마-리놀렌산의 함량이 총 지방산중 16.8%로 높고 직경 1mm미만의 적은 펠렛을 형성하는 등 감마-리놀렌산의 생산균주로서의 양호한 특성을 나타내었다. 이 균주는 형태학적 특성을 조사한 결과 Mucor sp.로 동정되었다. 이 균주가 생산하는 지질은 81.1%가 중성지질, 7.2%가 당지질 그리고 11.8%가 인지질로 밝혀졌으며, 감마-리놀렌산은 당지질에는 거의 없고 중성지질에 전체량의 대부분이 존재하였으며 인지질에는 인지질 획분 지방산의 21.4%를 차지하여 상대적으로 다량 존재한 것으로 나타났다.
In order to study the influence of culture conditions on cell growth and lipid formation by Mucor sp, various carbon and nitrogen sources initial pH and C./N ratio of medium were investigated. Glucose was found to be suitable carbon source in terms of lipid yield and ${\gamma}$-linolenic acid(GLA) content. When NH4Cl and (NH4)2SO4 were used as nitrogen source lipid content was high(19-21%) but GLA content was low(15-17%) On the other hand when NaNO3 and KNO3 were used lipid content was low(about 13%) but GLA content was high(22-23%). The highest production of lipid was obtained at a C/N ratio of 40 using glucose and (NH4)2SO4 as carbon and nitrogen source respectively. it was found that lipid yield was high at pH4.6 Also this fungus did not grow at 35$^{\circ}C$ and lipid yield was highr at 15$^{\circ}C$ than $25^{\circ}C$.
탄소원과 질소원, 배지의 초기 pH 및 C/N비가 Mucor sp. KCTC 8405P의 감마 리놀렌산 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 탄소원으로는 포도당이, 질소원으로는 황산 암모늄같은 무기 질소원과 요소, 펩톤같은 유기질소원이 균체 유지함량 및 감마 리놀렌산 수율 측면에서 양호한 것으로 판명되었다. 사용하는 질소원은 일정농도 이하로 제한할 필요가 있으며 포도당과 황산 암모늄을 사용할 경우 최적 C/N비는 약 56.6으로 조사되었다. 균체 유지함량을 증가시키기 위한 배지의 초기 pH는 8 또는 9가 유리한 것으로 나타났으며, 포도당과 sodium acetate를 혼합하여 탄소원으로 사용하는 것이 바람직한 것으로 조사되었다. 3% 포도당과 2% sodium acetate 를 탄소원으로, 0.1% 황산암모늄을 질소원으로 포함하는 배지를 사용하여 플라스크 교반배양을 실시한 결과 배지 100$m\ell$ 당 약 315mg의 균체유지량을 얻었고, 이중 감마 리놀렌산 함량은 약 13-14%로 조사되었다.
Mucor sp. KCTC 8405P 균주를 이용하여 초산나트륨이 $\gamma$-linolenic acid (GLA) 생산에 미치는 영향을 조사하였고 또한, 균체지질을 세포외로 분비시키기 위하여 비이온성 계면활성제를 처리하여 그 효과를 조사하였다. 2 초산나트륨을 첨가하는 경우 균체성장과 균체 총질함량을 16g/l와 4.77g/l로 증가시킬 수 있었고 이때 총지질에 대한 GLA 함량은 13.8를 나타내었다. 초산나트륨을 첨가하는 경우 배지의 초기 pH에 따라 균체성장이 크게 영향을 받는데 이것은 배지 주의 초산의 영향 때문인 것으로 추정되며 22mM 이상의 초산농도에서는 균체성장이 거의 일어나지 않았다. 초산나트륨을 첨가한 배지에서 용존산소의 공급을 감소시킴에 따라 균체성장과 총지질함량 및 GLA 함량이 급격히 감소하는 경향을 보였다. 균체지질을 세포 밖으로 분비시키기 위하여 여러가지 비이온성 계면활성제를 처리하여 보았는데 0.5 Tween 80, Span 80을 처리할 때 최고 193 mg/l, 263 mg/l의 GLA를 세포외로 분비시킬 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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