Listeria (L.) monocytogenes in samples could not be detected occasioally by faster growth of other Listeria spp. especially L. innocua. The aim of this study was to develop the differential media and multiplex polymerase chain reaction (PCR) assays for the rapid detection of L. monocytogenes. L. monocytogenes colonies were characterized by their ${\beta}$-hemolysis with fluorescence under 366 nm UV light on the Listeria hemolysis agar (LHA). L. innocua, a species commonly present in foods, did not produce ${\beta}$-hemolysis on LHA. Therefore, one or more colonies of L. monocytogenes were easily distinguished from large populations of L. innocua. The multiplex PCR assays were developed to distinguish from L. monocytogenes and other Listeria spp. with two pairs of primers. The primers were designed in 16S rRNA and listeriolysin O gene for specific amplification of all members of the genus Listeria and L. monocytogenes, respectively. The multiplex PCR assays produced 560 and 938 bp products in L. monocytogenes; only 938 bp products in the genus Listeria. The multiplex PCR assays could detect as little as 50 pg of L monocytogenes DNA. These results indicated that the differential media and multiplex PCR assays might be useful diagnostic tools for the rapid detection of L. monocytogenes.
소나무를 95% 에탄올로 추출하여 얻은 추출물을 40 mg/mL 첨가하였을때 Listeria monocytogenes Scott A, Listeria monocytogenes Brie I. isteria monocytogenes ATCC 19111 3균주의 성장이 억제되었으며 이를 다시 용매별로 순차 분획한 후 3균주에 대한 증식저해효과는 특히 ether 분획 물이 높게 나타났다. 소나무 추출물 40 mg/mL 첨가에 의해 Listeria monocytogenes 3균주 모두 균체의 성장 단계 중 유도기인 4시간째 회수한 균체에서 높은 생균수 감소 현상이 확인되었다. 전자현미경으로 확인한 균체의 형태는 대조구의 균체표면은 매끈하고 손상의 흔적이 없으나 처리구의 균체의 표면은 손상되었거나 형태가 이상을 일으킨 모습을 볼 수 있었다.
Listeria spp. were isolated from a total of 402 naturally contaminated domestic ready-to-eat (RTE) vegetable samples by the conventional Food and Drug Administration protocol and confinned by API-Listeria kit. Also, the susceptibility to 12 antibiotics, polymerase chain reaction (PCR) assay for virulence gene of pathogenic Listeria monocytogenes isolates, and in vitro virulence assay using myeloma and hybridoma cells from murine and human sources were tested. Among the samples, 17 samples (4.2%) were found to be contaminated with Listeria species. Among the 17 strains of Listeria spp. isolates, only 2 strains (11.8%) of L. monocytogenes and 15 strains (88.2%) of L. innocua were identified. Antibiotic susceptibility test showed that the Listeria spp. isolates were very susceptible to the antibiotics tested, except for nalidixic acid. Among 17 strains of Listeria spp., PCR analysis showed that 2 strains of L. monocytogenes isolates proved to have a virulence hly gene, but none of L. innocua had the hly gene. Also, hybridoma Ped-2E9 cells assay showed that only L. monocytogenes isolates killed approximately 95-99% hybridoma cells after 6 h, but L. innocua isolates had about 0-5% lethal effect. These results indicate that PCR assay with hly primer or hybridoma Ped-2E9 cells assay could be used as a good monitoring tool or in vitro virulence test for L. monocytogenes.
L. monocytogenes는 Listeriosis를 일으키는 중요한 식중독 균으로 현재 국내 식품공전에서는 증균배양을 기초로 검출하며, 규격은 불검출로 관리하고 있다. 그러나 Listeria종 간의 혼합오염시 증균 과정에서 경쟁생육이 존재하여 L. monocytogenes 위음성의 가능성이 있다고 보고되고 있다. 국내 식품공전은 L. monocytogenes 증균을 위한 1차 배지로 규정되어 있으나 LEB 배지에서의 Listeria 종 간의 생육 연구는 보고된 바 없다. 본 연구는 식품에서 주로 검출되는 Listeria 속 4종(L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri)을 LEB배지에 혼합배양하며 증균과정에서 생육의 차이가 존재하는 것을 확인하였다. 특히, L. innocua에 의해 L. monocytogenes의 생육이 저해되며, L monocytogenes가 L. innocua보다 초기균수가 2.0 log CFU/mL 이상 오염이 되어있어야지만 L. innocua보다 생육이 잘 되는 것을 확인하였다. Listeria 종 간의 혼합오염이 있을 경우 현재 검출법으로는 L. monocytogenes의 검출이 어려울 수 있다고 판단된다. 따라서 L. monocytogenes 검출율을 높이는 새로운 증균배지 개발의 필요성을 확인하였다. 향후 본 연구는 L. monocytogenes 검출률을 높여 국내 식품의 식품 안전에 기여 할 수 있으며 국내 식품 관리 규격 개정 시 기초가 되는 참고 자료로 활용 할 수 있을 것으로 생각된다.
Frequent outbreaks of foodborne illness demand the need for rapid and sensitive methods for detection of these pathogens. Recent development of biosensor technology has a great potential to meet the need for rapid and sensitive pathogens detection from foods. An antibody-based fiber-optic biosensor and an automated reagents supply system to detect Listeria monocytogenes were developed. The biosensor for detection of Listeria monocytogenes in PBS and bacteria spiked food samples was evaluated. The automated reagents supply system eliminated cumbersome sample and detection antibody injection procedures that had been done manually. The biosensor could detect $10^4$ cfu/ml of Listeria monocytogenes in PBS. By using the fiber-optic biosensor, $2x10^8$ cfu/ml of Listeria monocytogenes in the food samples were detectable.
The effect of organic acids on growth and heat resistance of Listeria monocytogenes Scott A were investigated. The growth of L. monocytogenes was inhibited in Tryptic Soy Broth(TSB) with 0.1 or 0.2% of acetic , tartic , propionic , citric and lactic acid at 35$^{\circ}C$, respectively. The growth of l. Monocytogenes did not occur in TSB with 0.2% of acetic acid or propionic acid during 48h of incubation. The heat resistance of L.monocytogenes was affected by kind of organic acid, ph and heating substrate. L.monocytogenes showed more heat resistant in TSB with various organic acids than in 0.1M sodium phosphate with the same organic acids. Heat resistance decreased as pH of heating substrate decreased . Surface-adherent microcolony was more heat resistant than planktonic cell of L. monocytogenes. Propionic and lactic acids more affected on heat resistance of L.monocytogenes than acetic , tartaric and citric acids.
국내 유통중인 냉동만두와 피자 중 L. monocytogenes의 분포와 분리균의 특성을 조사하기 위하여 1998년 8월부터 11월에 걸쳐 시료 72개를 구입하여 실험하였다. 전체 냉동식품 중 9.7%(7개)에서 L. monocytogenes가 분리되었으며 냉동만두 중 11.1%,피자 중 5.6%가 오염되어 있었다. USDA와 FDA방법. 그리고 modified cold enrichment 방법 중 USDA방법이 가장 L. monocytogenes의 분리율이 높았으며 분리된 L. monocytogenes 혈청형은 4였다. PCR실험결과 CAMP test와 API Listeria kit를 사용하여 분리된 균주가 L. monocytogenes임이 확인되었다. USDA방법과 PCR을 이용하여 L. monocytogenes를 분리하고 확인하는데 3-4일 정도의 시간이 소요되어 시간을 단축시킬 수 있는 분리 및 확인방법의 개발이 필요하리라 사료된다. 분리된 L. monocytogenes의 내열성을 조사한 결과 tryptic soy broth에서 D값이 $60^{\circ}C$에서 49.2초, $65^{\circ}C$에서 8.8초였으며 냉동식품의 안전한 사용을 위하여 L. monocytogenes의 분리율이 높은 식품에서 D값의 측정이 필요하다고 사료된다.
The polymerase chain reaction (PCR) amplification technique was used for comparison of Listeria monocytogenes serotypes. PCR primers for the fragment of invasion-associated protein (iap) gene were highly specific for all the serotypes of L. monocytogenes. Other Listeria spp., such as Listeria ivanovii and Listeria innocua were not produced the PCR fragments by above primer set. The nucleotide sequences of PCR products showed high homologies in comparison of all the isolated serotypes except unknown type II-2. The deduced amino acid sequences of the PCR products also showed similar to one another. The various region of the PCR products, called a Thr-Asn repeat region was presented. All of isolated L. monocytogenes serotypes possessed 16 to 20 Thr-Asn repeats.
Highly lethal Listeria monocytogenes, causing bromatoxism through vegetables, dairy products, meat products and shellfish etc, was examined for possible contamination in market beef. USDA, FDA, Malthus and Modified Cold Enrichment methods were used for the detection of Listeria spp.. Samples of domestic and imported market beef were collected from local meat shopsat Seoul, Korea. Total two hundreds and six of Listeria spp. were isolated and identified from beef. Among 206 isolates, the number of L. welshimeri was one hundred and twenty-one(44.8%). The numbers of isolated L. innocua, L. murrayi, L. monocytogenes, L. grayi, L. seeligeri, and L. ivanovii were 49(18.1%), 14(5.2%), 12(4.4%), 6(2.2%), 2(0.7%), and 2(0.7%), respectively. Detection rates of Listeria spp. varied among four methods. The highest detection rate of Listeria spp. in market beef was found at USDA method and that of L. monocytogenes was found at Malthus method.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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