여과제균한 배추즙에 김치에서 분리한 7주의 젖산균을 단독 접종하고 1$0^{\circ}C$, 2$0^{\circ}C$, 3$0^{\circ}C$ 및 4$0^{\circ}C$에서 배양하면서 각각의 증식곡선을 작성하고, 이를 이용하여 각 배양온도에서의 유도시간과 세대시간을 구하였다. 3$0^{\circ}C$에서 배양할 때의 유도시간은 Leu. mesenteroides subsp. dextranicum은 168분, Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides는 204분, Leu. paramesenteroides는 612분, Lac. bavaricus는 258분, Lac. homohiochii는 228분, Lac. plantarum은 270분 그리고 Lac. brevis는 264분이었고, 세대시간은 Leu. mesenteroides subsp. dextranicum 및 Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides는 36분, Lac. bavaricus는 33분, Lac. homohiochii는 39분, Lac. plantarum은 66분, Lac. brevis는 42분 그리고 Leu. paramesenteroides는 162분이었다. 배양온도를 3$0^{\circ}C$에서 1$0^{\circ}C$로 낮출 때 모든 균주들의 유도시간과 세대시간이 크게 연장되었는데, 이러한 연장은 Lac. plantarum에서 더욱 현저하게 나타났다. 1$0^{\circ}C$, 2$0^{\circ}C$ 및 3$0^{\circ}C$에서는 Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides의 유도시간과 세대시간이 Lac. plantarum의 그것보다 더 짧았다. 그러나 4$0^{\circ}C$에서는 이러한 양상이 완전히 전도되었다. 전반적으로 보아 배양온도가 낮아질수록 Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides의 증식에 상대적으로 더 유리하였고, 배양온도가 높아질수록 Lac. plantarum의 증식에 상대적으로 더 유리하였다.
Growth curves of seven strains of lactic acid bacteria isolated from Kimchi were graphed, when they were cultivated at 3$0^{\circ}C$ in filter sterilized Chinese cabbage juice containing 0, 2, 4 and 6% salt, and then lag time and generation time were calculated. The shapes of growth curves were changed differently among strains, as salt concentrations were increased. The addition of 2~4% salt resulted in prolongation of lag time were most omspicuous in Leu. Paramesenteroides and Leu. Mesenteroides subsp. Dextranicum, and the next in Leu. Mesenteroides subsp. Mesenteroides,m Lac. Bavaricus and Lac. Gomohiochii, and the least in Lac. Plantarum and Lac. Brevis. And then the prolongations of generation time were most remarkable in Lac. bavaricus and Lac. Homohiochii, and the next in Leu. Mesenteroides subsp. Mesenteroides, Leu. Mesenteroides subsp. Dextranicum and Leu. Paramesenteroides, and the least in Lac. Plantarum and Lac. brevis. By increasing salt concentrations from 0 to 2%, the generation times of Leu. Cesenteroides subsp. Dextranicum and Leu. Mesenteriodes subsp. Mesenteroides were prolonged slightly, while those of Lac. Homohiochii and Lac. Brevis were not changed, and those of Lac. Plantarum, Lac. Bavaricus and Leu. Paramesenteroides were shortened slightly. As salt concentrations were increased from 2% to 4%, inversions in the order of generation time occurred among strains. As a whole, lower salt concentrations were more favorable for the growth of Leuconostoc strains, while higher salt concentrations were for Lactobacillus strains.
저온발효된 김치에서 분리되어 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leu. mesenteroides subsp. dextranicum, Leu. paramesenteroides, Leu. lactis, Lactobacillus bavaricus 및 Lac. homohiochii로 각각 동정된 저온성 젖산균 60주에 대하여 여러 조건에서의 배양특성들을 조사하였다. 모든 균주들이 $5^{\circ}C,\;10^{\circ}C$ 및 $37^{\circ}C$에서 증식하였고, $45^{\circ}C$에서는 증식하지 못하였다. 최적 증식 온도는 Leu. mesenteroides의 균주들은 $33{\sim}34^{\circ}C$이었고, Lactobacillus속의 균주들은 $34{\sim}36^{\circ}C$이었다. Leu. mesenteroides와 Lactobacillus속의 균주들은 모두 초기 pH 4.8 및 4.2에서 증식하였으나 4.0에서는 증식하지 못하였다. Glucose broth에서의 최종 pH는 Leu. mesenteroides의 균주들은 $3.85{\sim}4.10$이었고, lactobacillus속 균주들은 $3.82{\sim}3.99$이었다. 60균주 모두 litmus milk에서 우유를 응고시키지 못하였고, litmus를 환원시키지도 못하였다. Leu. mesenteroides와 Lactobacillus속의 균주들은 모두 에탄올 7% 함유배지와 NaCl 6.5% 함유배지에서 증식하였고, 에탄올 15% 함유배지와 NaCl 10% 함유배지에서는 증식하지 못하였다. 모든 균주들이 pH 3.5인 인공위액과 40%의 담즙액에서 내성을 나타내었다. 특히 Leu. mesenteroides의 균주들은 모두 pH 3.0인 인공위액에서도 내성을 나타내었다. 본 젖산균들의 생리적인 특성은 여러 점에서 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 기재된 내용들과 일치하지 않으므로 더욱 정밀한 조사를 실시하여 분류학상의 위치를 정확히 밝혀 볼 필요가 있을 것으로 생각되었다.
김치로부터 3종의 EPS 생성 유산균을 분리하였다. 분리균주는 Leuconostoc kimchii, Leuconostoc citreum, Leuconostoc mesenteroides로 동정되었으며, 각각 Leuconostoc kimchii GJ2, Leuconostoc citreum C3, Leuconostoc mesenteroides C11로 명명하였다. EPS생성 김치유산균의 장내 정착성 여부 확인 결과 pH 3.0의 0.05 M sodium phosphate buffer와 인공위액에서 2시간 처리한 후에도 3균주 모두 초기균수($10^8\;CFU/ml$)를 유지하였으며 인공담즙에서 24시간 처리한 후에도 3균주 모두 초기균수($10^8\;CFU/ml$)를 유지하며 3종의 EPS생성 김치유산균 Leu. kimchii GJ2, Leu. citreum C3, Leu. mesenteroides C11이 장내 정착하면서 probiotics로서 작용할 수 있을 것임을 확인하였다. 반면, 대조군으로서 분리균주가 EPS를 생성하지 않았을 때의 경우에는 내산성, 인공위액, 인공담즙에서 처리 후 생균수가 $10^{1-2}\;CFU/ml$ 감소현상을 보여 균체의 EPS생성 여부가 probiotics로서 기능할 수 있는데 결정적 요인임을 보여주었다. 특히 Leu. kimchii GJ2의 경우 E. coli, Pseudomonas, Listeria, Micrococcus, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus속 등의 유해 균주에서 항균활성을 나타내었으며, 생산 항균물질은 단백질성 물질로 확인되었다. 김치유산균 Leu. kimchii GJ2, Leu. citreum C3, Leu. mesenteroides C11로부터의 EPS 생성량은 sucrose(5%) 배지에서 각각 21.49 g/l, 16.46 g/l, 22.98 g/l 였으며, 정제 시에도 각각 14.61 g/l, 7.73 g/l, 4.77 g/l로 기존의 EPS 생성 유산균에서의 생산량에 비해 10배 이상의 높은 생산량을 나타내었다. TLC 및 HPLC를 이용한 EPS 구성 당 확인 결과 3균주 모두 glucose로만 구성된 homopolysaccharides로 확인되었다. EPS 생성량이 가장 좋은 Leu. kimchii GJ2의 평균 분자량은 360,606 Da이었으며, 나머지 두 균주에 대해서는 생성 EPS 형태와 점도의 차이로 미루어 보아 생성 EPS의 분자구조와 분자량이 서로 다른 것으로 판단하였다.
26균주의 젖산균을 증편 반죽에서 분리하여 dextransucrase 활성을 측정할 결과 T. halophilus 1-12가 36.95 DSU/mg으로 가장 높았다. 이 중 Leu. mesenteroides subsp mesenteroides 2-9, T. halophilus 1-12, Leu. mesenteroides subsp dextranicum 5-13을 선별하여 starter로 이용하였다. 증편의 점도변화를 관찰한 결과 Leu. mesenteroides subsp mesenteroides 2-9를 첨가한 증편은 발효 적기인 2시간째에 첨가량이 많을수록 점도가 높아졌고 T. halophilus 1-12를 첨가한 증편의 경우는 첨가량에 따라 차이 없이 증편의 점도가 증가하였다. Leu. mesenteroides subsp dextranicum 5-13를 첨가한 증편 반죽의 경우에는 첨가량에 차이 없이 starter 균을 첨가하지 않은 증편 반죽의 발효패턴과 같은 점도 변화를 보였다. 증편반죽의 pH는 Leu. mesenteroides subsp mesenteroides 2-9 와 T. halophilus 1-12를 첨가한 경우 첨가량이 증가할수록 초기 pH도 낮았으며 발효가 진행되면서 계속 감소되는 경향을 보였다. 그러나 Leu. mesenteroides subsp dextranicum 5-13의 경우에는 첨가량에 따른 유의적인 차이가 없이 발효가 진행되면서 감소하는 패턴을 보였다. 증편의 비체적은 Leu. mesenteroides subsp dextranicum 5-13 1.0% 첨가한 군이 2.00으로 가장 높았고, T. halophilus 1-12를 1.0% 첨가한 군이 0.33으로 가장 낮았다. 증편의 단면을 관찰한 결과 Leu. mesenteroides subsp mesenteroides 2-9를 0.5 % 첨가한 것이 균일하였고, T. halophilus 1-12는 첨가량이 많을수록 기공이 거칠고 불규칙하였다. 반면 Leu. mesenteroides subsp dextranicum 5-13를 첨가한 군은 첨가량이 많을수록 기공이 균일하고 부피가 증가한 것을 볼 수 있었다. Texture는 Leu. mesenteroides subsp dextranicum 5-13를 0.5%, 1.0% 첨가한 증편이 hardnesubsp과 gumminesubsp, chewinesubsp가 대조군에 비해 매우 유의적으로 감소하였다. 관능검사를 실시한 결과 Leu. mesenteroides subsp dextranicum 5-13 0.5%를 첨가한 시료가 전체적인 기호도에서 8.500을 받아 매우 우수한 것으로 나타났다.
$5{\sim}7^{\circ}C$의 저온에서 20일 및 50일간 각각 발효된 A 및 B의 두 김치시료에서 저온성 젖산균 각각 30주씩을 무작위로 분리하고 동정을 하였다. 김치 A에서 분리한 30주 중 14주는 Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides로, 12주는 Leu. mesenteroides subsp. dextranicum으로, 4주는 Lac. bavaricus로 각각 동정되었고, 김치 B에서 분리한 30주 중 20주는 Lac. bavaricus로, 3주는 Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides로, 3주는 Leu. lactis로, 2주는 Leu. paramesenteroides로, 2주는 Lac. homohiochii로 각각 동정되었다. 비록 본 균주들이 위와 같이 동정되었지만 당류발효 pattern과 arginine에서 $NH_3$의 생성능이 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 기재된 내용과 일치하지 않는 균주가 많았고, Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides와 Leu. mesenteroides subsp. dextranicum으로 동정된 균주들 중의 일부는 당류발효 pattern이 동일 subspecies의 균주들 사이보다 다른 subspecies와 더욱 일치하는 모순까지 드러내었다. 이들 저온성 젖산균들을 기존의 체제에 따라 분류함에는 어려움이 따랐으며 이의 해결을 위한 후속연구가 요구되었다.
Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주는 모유에서 분리되었으며 16S rRNA 유전자 염기서열 분석과 자당(2%)이 포함된 tryptic soy agar plate상에서의 덱스트란 생성능을 통하여 동정하였다. Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주는 미세먼지 속에 존재하는 피부 유해성 중금속인 납과 카드뮴에 대한 흡착능이 있으며 이러한 성질은 사균 상태에서도 확인되었다. 또한 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주는 여드름 원인균인 P. acnes 균주에 대하여 항균활성을 나타내었다. 마지막으로 피부 건강기능소재로 잘 알려진 녹차, 당근, 개똥쑥, 파슬리, 브로콜리 및 옥수수수염 추출물을 기본 배지(A)로 하여 2% 자당(B) 혹은 2% 자당과 3% 효모추출물(C)을 각각의 추출물에 첨가한 후 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주를 접종 및 배양하여 덱스트란 생산량을 확인한 결과 C 배지가 최적배지로 확인되었으며 덱스트란의 생산은 주사전자현미경 사진으로도 관찰되었다. 결론적으로 모유 유래의 Leu. mesenteroides CJNU 0705 균주나 이를 이용한 천연발효추출물은 피부 건강기능소재로 활용될 수 있을 것이다.
In order to screen lactic acid bacterial starter having high antibacterial activity and giving good flavor in Dongchmi for Naengmyon antibacterial activity and acid producing ability of 24 strains of Kimchi lactic acid bacteria were tested. Among 24 strains tested Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides C16, Leu. paramesenteroides C18 Lactobacillus bavaricus B01, B06, C19, C32 Lac. homohiochii B21 and B22 showed high antibacterial activity and their antibacterial activities were more active against Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus than against Escherichia coli and Salmonella typhimurium. The odors of Dongchimi-juices fermented with Leu. mesenteroides or Leu. paramesenteroides were more favorable than those with Lac. bavaricus or Lac. homohiochii. But the odors of Naengmyon-broths which were made with each Dongchimi-juice were not significantly different each other. In consideration of antibacterial ac-tivity and flavor of Dongchimi-juice two strains of lactic acid bacteria Lac. homohiochii B21 and Leu. mes-enteroides subsp. mesenteroides C16 were finally screened out as Dongchimi starters.
파, 마늘, 생강, 적생고추, 고추가루의 멸균 추출액의 농도가 2%와 4%가 되도록 첨가한 배지에서 김치의 주된 젖산균들인 Leu. mesenteroides와 Lac. plantarum의 생육을 조사하였는데, 모든 부재료가 Lac. plantarum의 생육을 저해하였으며 마늘은 이 균에의 저해효과가 가장 컸으며, 생강이 Leu. mesenteroides의 생육에 증진 효과를 보였고, 마늘이 역시 Leu. mesonteroides의 생육에 저해효과를 나타내었다. 마늘, 생강 및 고추가루의 연속분획추출 후 멸균액을 배지에 첨가해 역시 두균의 생육정도를 조사하였을 때 마늘의 부탄을 분획물이 두균의 생육에 저해효과를 보여 그 효과물질은 alkaloid나 flavonoid일 것으로, 또 생강과 고추가루의 물 분획물이 Leu. mesenteroides의 생육 촉진 효과를 나타낸 바 그 효과물질은 당류일 것으로 추정되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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