• Reproductive and Developmental Biology
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• 제39권3호
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• pp.59-67
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• 2015

동물의 장기를 인간에게 이식하게 되면 초급성거부반응(Hyperacute rejection, HAR)이 일어난다. 초급성거부반응은 면역계의 구성요소 중 보체(complement)에 의해 일어나는 거부반응으로 돼지의 혈관세포 표면에 있는 $Gal{\alpha}$(1,3)Gal 당분자에 인간의 항체가 즉각 반응하기 때문에 일어나며, ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase(${\alpha}1,3$-GT) 유전자는 돼지 혈관세포 표면의 $Gal{\alpha}$(1,3)Gal 당분자 생성에 관여한다. 따라서 인간에게 돼지의 장기를 이식하기 위해서는 ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase 유전자를 제거하는 것이 필요한 것으로 알려져 있다. 본 연구실의 이전 연구에서, 시카고 미니돼지 귀체세포에서 상동 재조합(Homologous recombination)을 통해 ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase 유전자가 제거된 체세포를 개발한 바 있으며, 이 체세포를 통하여 ${\alpha}1,3$-GT 유전자가 제거된 돼지도 생산된 바 있다. 본 연구에서는, human serum 처리 시 돼지 세포를 보호해 준다고 보고되고 있는 human complement regulator인 human Decay-accelerating factor(hDAF)와 human ${\alpha}1,2$-fucosyltransferase(hHT)유전자를 ${\alpha}1,3$-GT 유전자 위치에 gene targeting하여 동시에 hDAF와 hHT가 발현하는 체세포를 개발하였다. Knock-in vector는 hDAF와 hHT 두 유전자가 발현할 수 있도록 IRES로 연결하였으며, ${\alpha}1,3$-GT 유전자의 start codon을 이용하여 발현할 수 있도록 구축하였다. 구축한 vector는 electroporation을 통해 미니 돼지 체세포에 도입하였으며, PCR 결과, ${\alpha}1,3$-GT 유전자 위치에서 상동 재조합이 일어났음을 확인하였다. Positive-negative 선별 방법을 통해 얻은 gene targeting 된 체세포는 RT-PCR에 의해 hDAF와 hHT 유전자의 발현이 확인되었으며, 대조군(NIH minipig)에 비해 ${\alpha}1,3$-GT 유전자의 발현이 감소하였다. 또한 이들 세포에 100% human complement serum을 처리하였을 때 knock-in 세포가 대조군에 비해 30% 정도 더 높은 생존율을 보였다. 따라서 개발된 체세포는 이종간 장기이식을 위한 돼지 생산과 함께 이를 이용한 이종간의 장기 이식 시 초급성 거부반응을 억제하는 데 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

• BMB Reports
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• 제56권2호
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• pp.102-107
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• 2023

Genome editing using CRISPR-associated technology is widely used to modify the genomes rapidly and efficiently on specific DNA double-strand breaks (DSBs) induced by Cas9 endonuclease. However, despite swift advance in Cas9 engineering, structural basis of Cas9-recognition and cleavage complex remains unclear. Proper assembly of this complex correlates to effective Cas9 activity, leading to high efficacy of genome editing events. Here, we develop a CRISPR/Cas9-RAD51 plasmid constitutively expressing RAD51, which can bind to single-stranded DNA for DSB repair. We show that the efficiency of CRISPR-mediated genome editing can be significantly improved by expressing RAD51, responsible for DSB repair via homologous recombination (HR), in both gene knock-out and knock-in processes. In cells with CRISPR/Cas9-RAD51 plasmid, expression of the target genes (cohesin SMC3 and GAPDH) was reduced by more than 1.9-fold compared to the CRISPR/Cas9 plasmid for knock-out of genes. Furthermore, CRISPR/Cas9-RAD51 enhanced the knock-in efficiency of DsRed donor DNA. Thus, the CRISPR/Cas9-RAD51 system is useful for applications requiring precise and efficient genome edits not accessible to HR-deficient cell genome editing and for developing CRISPR/Cas9-mediated knockout technology.

• 대한소아치과학회지
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• 제32권3호
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• pp.576-583
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• 2005

치아의 형성은 상피-간엽간의 상호작용을 통해 조절되어지는 복잡한 발생과정이다. 지금까지 치관의 발생에 관여하는 유전자 및 그들의 신호전달경로에 관한 연구는 다수 진행되어 왔지만 치근의 발생을 조절하는 기전에 대해서는 별로 알려진 것이 없다. 최근에 NFI-C knock out 생쥐에서 정상치관에 비정상적인 치근을 가지는 치아가 보고되었다. 본 연구의 목적은 NFI-C가 어떻게 치근의 형태와 상아모세포의 분화에 관여하는지를 규명하는 것이다. NFI-C knock out 생쥐의 치근 발생동안에 HERS의 역할을 연구하고자 cytokeratin 면역조직화학적방법과 치근상아질의 특성을 규명하기 위해 DSPP mRNA in-situ hybrydization법을 수행하였다. 1. NFI-C knock out 생쥐의 치근형성시 HERS의 역할 Wild type과 knock out type 모두에서 cytokeratin은 모든 HERS 세포들과 반응하였고, HERS와 법랑상피 사이의 양성반응세포들의 연속성은 치경부 부위에서 소실되었다. Knock out type에서 치근상아질이 침착된 후, cytokeratin 양성-HERS 세포들은 치경부에서 불규칙한 배열과 극성의 상실을 보였다. 2. NFI-C knock out 생쥐의 치근상아질의 특성 DSPP mRNA의 발현은 wild type에서 치관과 치근상아질의 상아모세포 모두에서 강한 발현을 보인 반면, knock out type에서는 치관부위 상아질의 상아모세포에서만 강한 발현을 보였다. 3. NFI-C knock out 생쥐의 치근 발생과정에서 HERS는 치관으로부터 정상적인 확장을 보인 반면, 치근부위에서의 상아 모세포 분화는 실패하였다. 위의 결과들로 보아 NFI-C는 치근형성 과정에서 상아모세포 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제16권4호
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• pp.363-370
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• 2012

The outer dense fiber 2 (ODF2) protein is an important component of sperm tail outer dense fiber and localizes at the centrosome. It has been reported that the RO072 ES cell derived homozygote knock out of ODF2 results in an embryonic lethal phenotype, and XL169 ES cell derived heterozygote knock out causes severe defects in sperm tail development. The ODF2s splicing variant, Cenexin1, possesses a C-terminal extension, and the phosphorylation of serine 796 residue in an extended C-terminal is responsible for Plk1 binding. Cenexin1 assembles ninein and causes ciliogenesis in early stages of the cell cycle in a Plk1-independent manner. Alternatively, in the late stages of the cell cycle, G2/M phase, Cenexin1 binds to Plk1 and results in proper mitotic progression. In this study, to identify the in vivo function of Plk1 binding to phosphorylated Cenexin1 S796 residue, and to understand the in vivo functional differences between ODF2 and Cenexin1, we generated ODF2/Cenexin1 S796A/Cenexin1 WT expressing transgenic mice in a RO072 ES cell derived $ODF2^{+/-}$ knock out background. We observed a severe defect of sperm tail development by ectopic expression of Cenexin1 S796A mutant and no phenotypic differences between the ectopic expression of ODF2/Cenexin1 WT in $ODF2^{+/-}$ background and in normal wild type mice.

• BMB Reports
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• 제43권9호
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• pp.629-634
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• 2010

Endotoxin including lipopolysaccharide (LPS) confers organ tolerance against subsequent challenge by ischemia and reperfusion (I/R) insult. The mechanisms underlying this powerful adaptive defense remain to be defined. Therefore, in this study we attempted to determine whether nitric oxide (NO) and its associated enzymes, inducible NOS (iNOS) and endothelial NOS (eNOS, a constitutive NOS), are associated with LPS-induced renal tolerance against I/R injury, using iNOS (iNOS knock-out) or eNOS (eNOS knock-out) gene-deleted mice. A systemic low dose of LPS pretreatment protected kidney against I/R injury. LPS treatment increased the activity and expression of iNOS, but not eNOS, in kidney tissue. LPS pretreatment in iNOS, but not eNOS, knock-out mice did not protect kidney against I/R injury. In conclusion, the kidney tolerance to I/R injury conferred by pretreatment with LPS is mediated by increased expression and activation of iNOS.

• 원예과학기술지
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• 제30권6호
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• pp.734-742
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• 2012

본 연구는 배추의 유전자 기능분석을 위한 RNAi 유전자 침묵 기법과 T-DNA 삽입 기법을 비교하기 위해 수행하였다. 두 종류의 형질전환 계통이 이용되었으며 BrSAMS-knockout(KO) 계통은 T-DNA 삽입으로 한 개의 Brassica rapa S-adenosylmethionine synthetase(BrSAMS) 유전자가 기능을 상실한 계통이었으며 BrSAMS-knockdown(KD) 계통은 RNAi 방법을 통해 BrSAMS 유전자들의 발현이 억제된 계통이었다. KO 계통과 KD 계통의 microarray 분석 결과에서는 SAMS 유전자와 관련된 sterol, 자당, homogalacturonan 생합성 및 glutaredoxin-related protein, serine/threonine protein kinase, 그리고 gibberellin-responsive protein 유전자들의 발현 수준이 뚜렷한 차이를 보여 주었다. 그러나 KO 계통의 유전자 발현 양상은 하나의 BrSAMS 유전자가 기능을 상실하였음에도 불구하고 대조 계통과 비교하여 RNAi기법을 적용한 KD 계통에 비해 큰 차이를 보여주지 못했다. 또한 직접적으로 SAMS 유전자와 관련된 폴리아민과 에틸렌 합성 유전자들의 발현 변화도 KD 계통에서 더 잘 나타났다. 본 연구에서 microarray 결과를 이용한 KO 계통의 BrSAMS 기능분석은 배추과식물의 게놈 triplication 발생으로 인하여 다수로 존재하는 SAMS 유전자들 때문에 명확한 결론을 얻을 수 없었다. 결론적으로 배추와 같은 배수체 작물의 유전자 기능 분석은 RNAi silencing에 의한 유전자 knock-down 기법이 T-DNA 삽입에 의한 knock-out 기법보다 더욱 효율적인 것으로 나타났다.

• 생명과학회지
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• 제24권12호
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• pp.1269-1275
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• 2014

TALEN은 특정유전자를 표적 하여 knock-out 시킬 수 있는 새로운 개념의 유전자 클로닝 방법이다. TALEN 플라스미드에는 DNA binding 도메인과 Fok1 절단효소 기능이 융합되어 있기 때문에, genomic DNA 의 어느 부위라도 결합할 수 있고, 표적 염기서열을 절단하여 유전자 돌연변이를 유도할 수 있다. 본 연구에서 우리는 SETDB1 HMTase 유전자의 단백질 개시코돈 과 프로모터 -25 upstream 부위를 표적 하는 두 종의 TALEN constructs 를 제작하였다. 이를 위하여 두 단계의 클로닝이 진행되었다. 첫 번째는 모듈벡터에서 pFUS배열벡터로 표적서열을 옮겨 콜로니 PCR을 통해 smear밴드와 Esp1 제한 효소를 이용하여 약 1 kb의 insert가 들어 있음을 확인하였다. 두 번째는 배열 벡터로부터 TALEN 발현벡터로 옮기는 과정을 진행하였으며, 염기서열분석을 통해 확인하였다. 그 결과 최초의 고안된 모듈벡터 서열들이 약 100 bp 간격으로 배열되어 있음을 확인하였다. 제작된 TALEN-DBEX2 construct는 transfection을 통해 SETDB1의 발현이 사라지는 것을 확인하였고, T7E1 분석을 통하여 표적부위에서 돌연변이가 발생하였음을 추정할 수 있었다. 한편, TALEN-DBPR25 transfection을 통하여서도 SETDB1의 발현이 감소하는 현상을 확인 하였다. DBEX2, DBPR25를 이입시킨 HeLa 세포에서 세포 형태가 길어지는 현상을 관찰할 수 있었다. 그러므로 단백질 개시코돈 또는 -25 upstream을 표적 하는 TALEN knock-out 방법은 SETDB1 유전자의 기능연구에 매우 유용하다고 사료된다.

• 한국동물생명공학회지
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• 제34권3호
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• pp.148-156
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• 2019

The Transgenic livestock can be useful for the production of disease-resistant animals, pigs for xenotranplantation, animal bioreactor for therapeutic recombinant proteins and disease model animals. Previously, conventional methods without using artificial nuclease-dependent DNA cleavage system were used to produce such transgenic livestock, but their efficiency is known to be low. In the last decade, the development of artificial nucleases such as zinc-finger necleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas has led to more efficient production of knock-out and knock-in transgenic livestock. However, production of knock-in livestock is poor. In mouse, genetically modified mice are produced by coinjecting a pair of knock-in vector, which is a donor DNA, with a artificial nuclease in a pronuclear fertilized egg, but not in livestock. Gene targeting efficiency has been increased with the use of artificial nucleases, but the knock-in efficiency is still low in livestock. In many research now, somatic cell nuclear transfer (SCNT) methods used after selection of cell transfected with artificial nuclease for production of transgenic livestock. In particular, it is necessary to develop a system capable of producing transgenic livestock more efficiently by co-injection of artificial nuclease and knock-in vectors into fertilized eggs.

• BMB Reports
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• 제53권9호
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• pp.484-489
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• 2020

Epilepsy is a neurological disorder characterized by unpredictable seizures, which are bursts of electrical activity that temporarily affect the brain. Cereblon (CRBN), a DCAFs (DDB1 and CUL4-associated factors), is a well-established protein associated with human mental retardation. Being a substrate receptor of the cullin-RING E3 ubiquitin ligase (CRL) 4 complex, CRBN mediates ubiquitination of several substrates and conducts multiple biological processes. In the central nervous system, the large-conductance Ca²⁺-activated K⁺ (BK_Ca) channel, which is the substrate of CRBN, is an important regulator of epilepsy. Despite the functional role and importance of CRBN in the brain, direct injection of pentylenetetrazole (PTZ) to induce seizures in CRBN knock-out mice has not been challenged. In this study, we investigated the effect of PTZ in CRBN knock-out mice. Here, we demonstrate that, compared with WT mice, CRBN knock-out mice do not show the intensification of seizures by PTZ induction. Moreover, electroencephalography recordings were also performed in the brains of both WT and CRBN knockout mice to identify the absence of significant differences in the pattern of seizure activities. Consistently, immunoblot analysis for validating the protein level of the CRL4 complex containing CRBN (CRL4^Crbn) in the mouse brain was carried out. Taken together, we found that the deficiency of CRBN does not affect PTZ-induced seizure.

• 생명과학회지
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• 제12권2호
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• pp.219-225
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• 2002

진핵세포의 염색체는 전사, 복제, 회복 등의 과정에서 관여하는 단백질의 기능으로 구조가 변하게 된다. 이때 관여하는 단백질은 DNA-단백질의 상호작용에 의해서 이루어지게 되는데, 이때 단백질의 일부분은 일정한 상동성이 존재하게 된다. 이러한 부분은 motif나 domain으로 구성되는데, 예를 들면, SAP domain등을 들 수 있다. S. pombe genomic DNA 데이터베이스를 검색하여 Arabidopsis PARP 과 KU70과 상동성을 보이는 새로운 유전자를 찾았다. 이를 SAPuvs (SAP UV Sensitive)라 명명하였으며, Ura4를 선별표지로 이용하여 S. pombe SAPuvs 유전자 결실세포를 구성하였다. SAPuvs 유전자 결실세포는 자외선 조사 실험에서 정상의 세포에 비해 현저하게 죽었다. 그러나, MMS 또는 MMS와 3AB의 처리 실험에서는 저항성을 보였다. 이러한 결과로 SAPuvs는 DNA 상해회복에서 염색사구조 형성에 연관되어 있음을 확인하였다.