• 한국가축번식학회지
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• 제22권4호
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• pp.375-383
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• 1998

본 연구는 돼지 미성숙 난포란을 체외에서 성숙시킬 때, $\beta$-mercaptoethanol ($\beta$-ME) 및 Cysteamine 의 첨가 배양이 난핵포붕괴 및 핵성숙율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 본 연구에서 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 체외성숙 배양액인 TCM-199 에 $\beta$-ME 를 0, 10, 50, 100 및 200 $\mu$M 을 첨가하여 36 시간 동안 성숙을 유기 시킬 때 난핵포붕괴율은 각각 91.6, 92.5, 91.8, 91.9 및 92.7%로서 처리구간 유의성이 없는 높은 결과를 보였고, 핵성숙율은 각각 49.6, 41. 7, 32.5, 34.1 및 35.4%로서 대조구에 비하여 비교적 낮은 성숙율을 보였으며, 특히 50, 100 및 200 $\mu$M 첨가시 유의적으로 낮은 핵성숙율을 나타냈다 (P＜0.05). 또한, 44시간 동안 체외성숙을 유기시켰을 때 난핵포 붕괴율은 각각 91.8, 90.4, 92.5, 91.2 및 93.9%로서 처리구간 유의성 없이 높은 결과를 나타냈으며, 핵성숙율은 71.9, 58.8, 56.7, 62.2 및 56.5%로서 대조구에 비하여 모든 처리구에서 유의적으로 낮은 성숙율을 나타냈다 (P＜0.05). 2. 체외성숙 배양액인 TCM-199 에 cysteamine을 0, 10, 50, 100 및 200 $\mu$M 을 첨가하여 36 시간 동안 성숙을 유기시켰을 때 난핵포붕괴율은 각각 90.6, 86.3, 88.2, 87.2 및 90.0%로서 각 처리구간 높은 결과를 나타냈고, 핵성숙율은 53.8, 45.1, 54.4, 57.5 및 63.3%로서 대조구와 비슷한 결과를 나타냈으며, 특히, 200 $\mu$M 의 첨가구에서 유의적으로 높은 성숙율을 나타냈다 (P＜0.05). 또한, 44 시간 동안 체외성숙을 유기시켰을 때 난핵포붕괴율은 각각 89.5, 93.1, 85.1, 89.8 및 3%로서 모든 처리구에서 높은 결과를 나타냈으며, 핵성숙율은 각각 84.2, 77.6, 66.0, 67.8 및 78.3%로서 대조구에 비하여 전 처리구에서 다소 낮은 결과를 보였으며, 특히 50 및 100 $\mu$M 처리구에서 유의적으로 낮은 핵성숙율을 나타냈다 (P＜0.05).

• 한국가축번식학회지
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• 제24권1호
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• pp.97-108
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• 2000

본 실험을 통하여 얻어진 결과를 요약하여 보면, 1. 소난포(＜2 mm), 중난포 (2~6 mm) 및 대난포 (＞6 mm)에서 각각 184개, 157개 및 101개의 난포란을 회수하여 442개의 난포란을 채취하였으며, 난포의 크기별로 볼 때 Grade I인 난포란의 회수는 소난포에서 64개 (34.8%), 중난포에서 31개 (19.7%) 및 대난포에서 5개 (5.0%)를 회수하였으며, 등급별 총 회수율은 Grade I, II 및 III 에서 각각 100개, 170개 및 172개를 회수하였다. Grade I, II, 및 III의 난소당 채란된 수는 각각 2.4개 및 4.2개로 평균 난소당 10.7개의 난포란을 회수하였다. Grade I, II, 및 III 의 미성숙 난포란, 각각 200개, 196개 및 203개를 체외성숙 배양액에서 22~24 시간동안 배양한 결과, 188개(94.0%), 155개 (79.1%) 및 147개 (72.4%)의 난포란이 성숙되었으며, 수정율은 각각 88.3%, 76.6% 및 72.5% 였다. Grade I의 난포란의 성숙율 및 수정율이 Grade II와 III에 비하여 유의적 (P＜0.05)으로 높게 나타났다. TCM-199 배양액, 난관 상피세포가 첨가된 배양액 또는 난관 상피세포의 단순배양액 (CM) 에서 상실배의 발달율은 각각 24.1%, 31.2% 및 21.9%로서 CM 배양액보다 난관 상피세포에서 유의적 (P＜0.05)으로 높은 발달율을 얻었으며, 배반포 수정란의 경우, 발달율이 각각 12.4%, 24.7% 및 18.2%로서 TCM-199 배양액보다 난관 상피세포를 첨가한 배양액에서 배양한 것이 유의적 (P＜0.05)으로 높은 발달율을 보였다. 2. 동결보호제에 대한 평형시간이 l분, 2분 및 3분일 때, 체외수정란의 생존율은 각각 82.9%, 73.3% 및 32.1%로서, 평형시간이 1분과 2분일 때의 생존율이 3분 동안 평형한 수정란보다 생존율이 유의적 (P＜0.05)으로 높았으며, 3분 동안 평형시에는 수정란의 생존율에는 치명적이었다. 배반포 수정란을 동결보존한 후의 생존율은 72.7%였으며, 상실배는 33.3% 가 생존하여 상실배보다는 배반포 수정란의 생존율이 유의적 (P＜0.05)으로 높게 나타났다. 3. 배반포 수정란을 105두의 수란우에 이식한 결과, 임신우 49두(46.7%)가 임신되었으며, 그 중에서 12.2% (6/49) 의 유산율과 6.1%(3/49)의 사산율을 보였고, 최종 40두(81. 7%)가 분만하였다. 이러한 결과로 보아 난포란의 체외배양 시 이식가능한 체외수정란의 생산율은 25%로서, 이는 난소 한개당 2.7개의 체외수정란 생산을 나타낸다. 생산된 수정란을 수란우에 이식한 결과 46.7% 의 임신율을 보여 향후 안정적인 쌍자 분만을 위해서 한우 수정란을 젖소의 대리모를 이용하는 방안에 대해 더욱 연구해 보아야 할 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제14권1호
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• pp.17-22
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• 1999

도축장에서 채취한 돼지난자를 직경별로 $5\mu\textrm{m}$ 간격으로 나누어, 난자의 크기에 따른 체외성숙과 발육능을 구명코자 체외성숙과 체외수정 후의 배 발달율을 조사하였다. 채취한 난자의 투명대를 제외한 평균직경은 $114.4\pm5.45\;\mu\textrm{m}$ 이었으며, 직경별 분포는 < 105, 105~110, 110~115,115~120, 120~125, $125\;\mu\textrm{m}$<이 각각 3.0, 11.0, 31.2, 41.5, 13.0 및 0.4%로 72.7%가 110부터 $120\;\mu\textrm{m}$ 사이였다. 체외성숙율에 있어서 직경 $105\;\mu\textrm{m}$ 미만난자는 66.7%인 반면 $105\;\mu\textrm{m}$ 이상의 난자는 91.8~100%로 유의적(P<0.05)으로 높았다. 체외수정율도 직경 $105\;\mu\textrm{m}$ 미만인 난자는 50% 이었던 반면, $105\;\mu\textrm{m}$이상은 8106~85.5%로 유의적(P<0.05)으로 높았다.다정자침입율에 있어서 $110\;\mu\textrm{m}$이상의 난자는 17.8~27.7%로 $105~110\mu\textrm{m}$ 의 37.5% 보다 낮았다. 난자의 직경별 배반포기까지의 발달율은 $105\;\mu\textrm{m}$ 이하는 전혀 발달하지 않았고(0%), $105~110\mu\textrm{m}$는 701%, $110~11\;5\mu\textrm{m}$ 12.5%, $115~120\; \mu\textrm{m}$ 24.0%, $120~125\; \mu\textrm{m}$ 18.3%, $120\; \mu\textrm{m}$<0%로, $115~120\; \mu\textrm{m}$ 직경난자의 체외발달율이 유의적(P<0.05)으로 높았다.이상의 결과를 종합할 때, 돼지의 체외수정용 나자는 직경 $110\; \mu\textrm{m}$ 이상을 이용하는 것이 생산성을 높일 수 있는 방법으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권1호
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• pp.27-34
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• 1996

본 연구는 immunosurgery와 polynucleotide-specific 형광물질을 이용한 differential labelling기법으로 체외에서 소 수정란의 배발달을 유기하는데 효과적인 것으로 알려진 CR1배양액을 사용하여 체외생산된 소 배반포기배의 inner cell mass (ICM)와 trophectoderm(TE)의 총 세포수를 조사하고자 실시하였다. 공시 배반포기배는 체외수정 후 8일째에 얻어졌다. 체외생산된 배반포기배는 배반포강의 확대와 투명대 두께의 감소를 기준으로 초기, 중기 및 팽윤단계로 구분하였으며, 또한 같은 배발달군내의 배반포기배는 다시 두 군으로 나누어 bisbenzimide만을 처리하여 얻어진 총세포수와 immunosurgery와 two polynulceotide-specific 형광물질을 이용하여 얻어진 ICM와 TE의 총세포수를 비교하여 얻어진 결과는 다음과 같다. 1) 체외수정 후 8일째 배반포기배의 발달율은 29.3%였으며, 초기, 중기, 팽윤 및 부화단계로 구분하였을 때의 발달율은 각각 8.7, 9.9, 7.6, 3.1%였다. 2) Bisbenzimide를 이용한 배반포기배의 총 세포수는 초기, 중기 및 팽윤단게가 각각 46.9$\pm$8.6, 66.2$\pm$12.5, 122.8$\pm$14.4를 나타냈다. 이러한 결과는 CR1이 소 수정란의 발달에 적절한 배양액임을 알 수 있었다. 3) Immunosurgery와 polynucleotide-specific 형광물질을 이용한 differential labelling기법으로 배반포기배의 ICM과 TE 세포수를 초기, 중기 및 팽윤단계로 나누어 조사한 결과, ICM 세포수는 각각 12.8$\pm$5.9, 26.3$\pm$8.4, 35.5$\pm$15.0개 이었고, TE 세포수는 각각 30.5$\pm$5.0, 41.3$\pm$8.2, 81.1$\pm$13.4개로 나타나 ICM과 TE 세포수는 초기 배반포기배에서 팽윤 배반포기배로 진행됨에 따라 두배에서 세배 정도 증가되었음을 알 수 있었다. 또한, differential labelling과 bisbenzimide기법에서 얻어진 각각의 총세포수를 비교하였을 때 총세포수는 발달의 진행 정도에 따라 증가되며 그와 동시에 동일한 군 간의 세포수도 거의 유사함을 알 수 있었다. 따라서, ICM과 TE를 differential labelling하는 기법은 수정란의 quality를 평가하는데 매우 유용한 기법으로서 착상전 embryo 발달을 연구하는데 효과적으로 이용될 수 있다는 것을 시사한다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제13권3호
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• pp.313-321
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• 1998

본 연구는 소 체외성숙, 체외수정 유래 배반포의 초자화 등결 시 동해방지제의 평형방법과 응 해 후 동해방지제의 희석방법이 수정란의 생존성에 미치는 영향을 검토하고자 실시하였다. 초자화 동결액은 20% FBS(Gibco)가 첨가된 D-PBS에 20% glycerol, 20% ethylene glycol, 3/8 M sucrose, 3/8 M deftrose 가 함유된 GESD를 사용하였다. 동결 전 평형방법은 3단계 (El), 2단계 (E2), 1단계(E3)로, 응해 후 희석방법도 Dl(VS3+1/2 M sucrose, 1/2 M sucrose, 1/4 M sucrose), D2 (1/2 M sucrose, 1/4 M sucrose) 및 D3 (1/2 M sucrose)로 구분하였다. 초자화동결 및 융해 후 생존율 은 E1구에서 배반포가 50% (27/54), 확장배반포가 83.6% (46/55)로, E2구 (16.7 및 23.2%) 및 E3구 (0 및 3.7%)에 비하여 유의적으로 높았다(P〈0.01). 융해 후 72시간째 부화율은, E1구에서 배반포가 27.8% (15/54), 확장배반포가 67.3% (37/55)로 E2구(7.4% 및 12.5%) 및 E3구 (0% 및 0%)에 비하석 유의적으로 높았다(P〈0.01). 발육단계별 생존율 및 부화율은 E1구에서 확장배반포의 경우가 배반포에 비하여 유의적으로 (P〈0.01) 높았다. 희석방법에 따른 생존율은 D2구에서 배반포가 52.0% (26/50), 확장 배반포가 80.6% (50/62)로, D1구 (29.6% 및 48.3 %) 및 D3구 (47.2% 및 63.8%)에 비하여 유의적으로 높았다(P〈0.05). 한편, 응해 후 72시간째 부화율은, 배반포의 경우는 세 구간에 차이가 없었으나, 확장배반포의 경우는 D2구에서 61.3% (38/62)로, D1구 (34.5%)에 비하여 유의적으로 높았다(P〈0.01). 발육단계별 생존율은 D1 및 D2구에서, 부화율은 D2 및 D3구에서 확장배반포가 배반포에 비하여 유의적으로(P〈0.01) 높게 나타났다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 초자화 동결된 소 수정란의 응해 후 생존성은 동결 전 평형방법 을 다단계로 나누어 실시하므로서 증진될 수 있으며, 응해 후 동해방지제의 희석방법은 동결 전평형에 비하여 생존율에 큰 영향을 미치지는 않으나, sucrose를 이용한 2단계 희석이 수정란의 생존성을 향상시키는 것으로 나타났다. 또한 발육 단계별 생존성에 있어서는 발육이 진전된 확장배 반포 시에 동결하는 것이 배반포기에 동결하는 것 보다 유리한 것으로 나타났다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제26권2호
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• pp.231-238
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• 1999

본 연구는 체외생산된 소 배반포기배를 발달 단계 및 배양일에 따라 구별하여 초자화 동결 및 융해하였을 때, 그 발달능을 유지하는지 확인하고자 실시하였다. 체외수정 후 8일간 배양된 배반포기 배는 20% ethylene glycol에 3분 동안 평형시키고, EFS40 (40% ethylene glycol, 18% ficoll, 0.3M sucrose 그리고 10% FBS가 함유된 mDPBS) 동결액에 30초 동안 노출한 후, 액체질소에 침지하여 초자화 동결되었다. 체외 생존 여부는 응해 24시간 및 48시간에 재팽창 및 탈출 또는 완전탈출로써 평가하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 체외수정 후 8일간 배 양하였을 때, 난할된 배의 배반포기 배로의 발달율은 41.0%였다 (초기 ; 7.6%, 팽창; 22.9%, 탈출; 4.6%, 완전탈출; 5.9%). 2) 배반포기배를 동결액에 노출 또는 초자화 동결하였을 때, 초자화 동결된 배반포기배의 재팽창율 (73.3%)은 대조군 및 동결액에 노출된 경우 (100, 97.0%)보다 낮았다 (p<0.05). 그러나 융해 48시간 후 탈출 또는 완전탈출 배반포기배 형성율은 초자화 동결된 경우 (66.7, 46.7%)와 노출된 경우 (66.7, 39.4%)는 유의한 차이를 나타내지 않았으나, 대조군(100, 100%)과는 차이를 보였다 (p<0.01). 그러나, 완전탈출까지 발달한 배반포기배의 총 세포수를 조사하였을 때, 각 처리군간의 유의한 차이는 없었다. 3) 배반포기배의 발달 단계에 따른 체외 생존율을 비교하였을 때, 재팽창율은 실험군간에 유의한 차이를 보이지 않았다 $(64.5{\sim}75.6%)$. 그러나 융해 48시간 후, 탈출 또는 완전탈출로써 평가된 초기 배반포기배의 발달율 (25.8, 9.7%)은 팽창 (69.7, 39.4%)및 탈출 배반포기배 (53.3, 43.3%)의 발달율보다 낮게 나타났다 (p<0.05). 4) 또한, 배양 7, 8 그리고 9일의 팽창 배반포기배를 초자화 동결하였을 때, 8일 및 9일간 배양된 배반포기배의 재팽창율은 7일간 배양된 경우보다 낮게 나타났다 (7일; 93.9%, 8일; 75.8%, 9일; 87.5%) (p<0.05). 그러나 완전탈출 배반포기배로의 발달율에서는 처리군간에 유의한 차이를 보이지 않았다 (7일; 36.4%, 8일; 36.4%, 9일; 31.3%). 이러한 결과는 EFS40을 이용한 2단계 초자화 동결 방법이 체외생산 된 팽창 및 탈출 배반포기배의 동결에 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.

• 한국가축번식학회지
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• 제23권2호
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• pp.141-148
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• 1999

본 실험은 체외 생산된 소 완전탈출 배반포기배의 생존능이 초자화동결 융해 후에도 유지될 수 있는지를 조사하고자 실시하였다. 완전탈출 배반포기배는 체외 수정 후 체외배양 9일과 10일에 얻었으며, 직경을 기준으로 small(S-HBs: ø$\leq$300 $\mu\textrm{m}$)과 large(L-HBs: ø＞300 $\mu\textrm{m}$)로 구분하였다. 동결액은 35% ethylene glycoJ(EG), 18% ficoll, 0.3 M sucrose와 10% FBS가 첨가된 mDPBS로 만들어진 EFS35를 사용했다. 완전탈출 배반포기배는 2 단계로 초자화동결되었는데, 10% EG에 5분간 평형 그리고 EFS35에 노출한 후 L$N_2$에 초자화되기까지 30~45초간 처리하였다. 체외에서의 생존능은 융해 후 2, 16 시간째의 재 팽창으로 조사하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 체외 수정 후 8 일째에 얻어진 배반포기배 (40.8%) 를 24~48 시간 추가배양했던 바, 체외 수정 후 9일째와 10일째의 완전탈출 배반포기배의 발달율은 20.5%와 6.7%였다. 또한, 완전탈출 배반포기배의 총 세포수를 조사하였던 바, 배양 9일째의 완전탈출 배반포기배의 총세포수 (232.7$\pm$16) 가 배양 10 일째의 완전탈출 배반포기배 057.5$\pm$9.3) 보다 많게 나타났다. 2) 체외수정 후 체외 배양 9일째 생산된 L-HBs 의 생존에 동결액이 미치는 영향을 조사하였던 바, 동결군 (75.5%) 이 대조군 (100%) 과 노출군 (100%) 에 비해 낮은 생존능을 보였다. 3) 완전탈출 배반포기배를 직경 (L-HBs, S-HBs)과 배양일로 구분하여 초자화동결된 난자의 생존에 미치는 영향을 조사하였던 바, 9일에 얻어진 완전탈출 배반포기배 (75.5%, 63.6%)는, 10일에 얻어진 완전탈출 배반포기배 (64.3%, 60.7%)보다 약간 높은 생존능이 있음을 알 수 있었다. 4) 융해 후 체외배조건이 난자의 생존능에 미치는 영향을 조사하였던 바, 동결 융해된 완전탈출 배반포기배의 생존능은 공배양 (43.2%, 41.9%)보다 mCR1aa (10% FBS) 배양액 (79.3%, 62.5%)에서 유의하게 높게 나타나는 것을 확인하였다 (p＜0.05). 따라서, 이러한 결과에서 볼 때 소 완전탈출 배반포기배는 EFS35 동결액을 사용하여 성공적으로 초자화동결 후 보존될 수 있음을 확인하였다.