• 한국식물병리학회지
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• 제14권3호
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• pp.223-228
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• 1998

Turnip mosaic virus)TuMV-Ca) was isolated from a Chinese cabbage showing severe mosaic and black necrotic spots symptoms in Korea. The virus was identified as a strain of TuMV by its host range test, particle morphology, serology, double stranded RNA analysis. For detection of the virus, reverse transcription and polymerase chain reaction(RT-PCR) was performed with a set of 18-mer TuMV-specific primers to amplify a 876 bp DNA fragment The virus was rapidly detected from total nucleic acids of virus infected tissues as well as native viral RNA of purified virion particles by RT-PCR. Detection limit of the viral RNA by RT-PCR was 10 fg.

• 대한환경공학회지
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• 제29권8호
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• pp.904-908
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• 2007

병원성 원생동물인 지아디아 람블리아는 수인성 질병을 야기하는 주요 원인이 되고 있다. 본 연구는 PCR 및 RT-PCR 기법을 적용하여 한강본류 하천수 시료에서 사람감염성 종인 지아디아 람블리아를 동정하고, 활성 여부를 판별하여 현 표준시험방법을 보완하고자 하였다. PCR과 RT-PCR에는 지아디아의 복부 흡반 구성 유전자를 증폭하는 giardin primer를 사용하였으며, DNA/RNA 추출 및 PCR/RT-PCR 과정에서의 민감도 검사를 수행한 결과, 1포낭까지 검출가능한 것으로 나타났다. 또한 한강본류 및 유입지천 시료 48점에 적용하여 면역형광항체법과 PCR 및 RT-PCR 방법을 비교하였다. 면역형광항체법을 이용한 현미경관찰 결과 48개 시료의 지아디아 총포낭수의 평균 농도는 6.3 cysts/10 L이었고 양성율은 62.5%였으며, 속빈 포낭을 제외한 지아디아의 평균 농도는 4.5 cysts/10 L이었고 양성율은 52.1%였다. PCR 수행결과 48개 시료 중 24개(50%)의 시료에서 지아디아 람볼리아가 검출되었으며, RT-PCR 수행결과 10개(21%) 시료가 살아있는 G. lamblia를 포함한 것으로 나타났다. 본 연구를 통해 PCR/RT-PCR 기법이 지아디아 포낭을 저농도로 포함하고 있는 하천수 시료에 적용가능하며 원생동물 표준시험방법을 보완하여 종(species) 및 활성에 대한 정보를 제공할 수 있을 것으로 결과되었다.

• 대한바이러스학회지
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• 제27권1호
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• pp.19-27
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• 1997

본 연구에서는 영장류에서 감염성 면역결핍 증상을 일으키는 type D simian retrovirus (SRV)를 검출하기 위해 SRV env 유전자의 특정 지역을 선정하여 증폭, 검색하는 중합효소 연쇄반응 (PCR)법을 개발하였다. 증폭반응의 대상부위인 SRV env 유전자의 3' 후반부는 서로 다른 3 종류의 SRV subtype 1, 2, 그리고 subtype 3에 걸쳐 높은 보존율을 보이고 있다. 반응 결과, 1차 PCR 만으로 3 종류의 SRV subtypes를 동시에 검출, 증폭하였으며 SRV와 더불어 영장류에서 감염성 면역결핍을 유도하는 주요 바이러스 simian immunodeficiency virus 또는 simian T-Iymphotropic virus type 1에 감염된 영장류의 peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)을 비교, 완전한 증폭 특이성이 확인되었고 교차반응으로 인한 위양성반응은 발견되지 않았다. 한편, 위 증폭반응의 검출 민감도 측정을 위해 준정량적 적정 PCR을 수행하였으며 SRV 게놈과 증폭 대상 부위의 분자량을 기준으로 한 본 PCR법의 검출 한계는 단 한번의 증폭과 간단한 ethidium bromide 염색만으로 적어도 $5-7{\times}10^4$ 개의 PBMCs 중 한 개의 감염세포를 검출할 수 있는 것으로 확인되었다. 본 연구에서 확인된 신속성과 반응 특이성, 그리고 높은 민감도의 본 PCR 법은 현재 유일한 AIDS 연구모델인 영장류의 SIV 감염 연구 전후에 반드시 필요한 효과적인 SRV 감염검색에서 ELISA법의 위양성에 의한 약점을 보완하고 보다 높은 검출 민감도를 확보함으로써 연구모델 실험의 오류를 최소화하는 데 중요한 역할을 하게 될 것이다.

• 식물병연구
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• 제18권2호
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• pp.73-79
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• 2012

Phytophthora katsurae는 밤나무 잉크병의 원인이 되는 병원성 균류이다. P. katsurae를 검출하기 위하여 2개의 duplex PCR primer set을 제작하였다(SOPC 1F/1R+KatI 3F/5R, SOPC 1-1F/1-1R+KatI 3F/5R). SOPC 1F/1R과 SOPC 1-1F/1-1R primer pair는 sequence characteristic amplification regions(SCAR)를 이용하여 제작하였고, KatI 3F/5R primer pair는 internal transcribed spacer(ITS) 부위로부터 제작하였다. 추출한 genomic DNA를 1 mg/ml에서 1 ng/ml까지 10배씩 순차적으로 희석하여 균사량에 따른 Duplex PCR의 민감도를 확인한 결과, 2개의 primer set은 각각 1 ${\mu}g/ml$와 100 ng/ml까지 검출이 가능하였다. 유주포자를 $1{\times}10^6$부터 $1{\times}10^2$ cells/ml까지 10배씩 순차적으로 희석하고 genomic DNA를 추출하여 P. katsurae의 유주포자량에 의한 검출 한계를 확인한 결과, 2개의 primer set 모두 $1{\times}10^5$ cells/ml까지 검출할 수 있었다. 각각의 primer set은 PCR 검출을 실시하였을 때 P. katsurae 균주에서만 PCR 산물이 증폭된 반면에, Phytophthora 16종에서는 P. katsurae에 특이적인 PCR 증폭산물이 생성되지 않았다. 따라서, 2개의 primer set을 이용한 Duplex PCR은 P. katsurae의 신속하고 효과적인 검출에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제45권4호
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• pp.358-364
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• 2017

Asymmetric PCR preferentially amplifies one DNA strand for use in DNA hybridization studies. Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR) is an advanced asymmetric PCR method which uses innovatively designed primers at different concentrations. This study aimed to optimise LATE-PCR parameters to produce single-stranded DNA of Candida spp. and Aspergillus spp. for detection via probe hybridisation. The internal transcribed spacer (ITS) region was used to design limiting primer and excess primer for LATE-PCR. Primer annealing and melting temperature, difference of melting temperature between limiting and excess primer and concentration of primers were optimized. In order to confirm the presence of single-stranded DNA, the LATE-PCR product was hybridised with digoxigenin labeled complementary oligonucleotide probe specific for each fungal genus and detected using anti-digoxigenin antibody by dot blotting. Important parameters that determine the production of single-stranded DNA in a LATE-PCR reaction are difference of melting temperature between the limiting and excess primer of at least $5^{\circ}C$ and primer concentration ratio of excess primer to limiting primer at 20:1. LATE-PCR products of Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis and Aspergillus terreus at up to 1:100 dilution and after 1 h hybridization time, successfully hybridised to respective oligonucleotide probes with no cross reactivity observed between each fungal genus probe and non-target products. For Aspergillus fumigatus, LATE-PCR products were detected at 1:10 dilution and after overnight hybridisation. These results indicate high detection sensitivity for single-stranded DNA produced by LATE-PCR. In conclusion, this advancement of PCR may be utilised to detect fungal pathogens which can aid the diagnosis of invasive fungal disease.

• The Plant Pathology Journal
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• 제32권5호
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• pp.414-422
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• 2016

Eucalyptus dieback disease, caused by Cylindrocladium scoparium, has occurred in last few years in large Eucalyptus planting areas in China and other countries. Rapid, simple, and reliable diagnostic techniques are desired for the early detection of Eucalyptus dieback of C. scoparium prior to formulation of efficient control plan. For this purpose, three PCR-based methods of nested PCR, multiplex PCR, loop-mediated isothermal amplification (LAMP) were developed for detection of C. scoparium based on factor 1-alpha (tef1) and beta-tubulin gene in this study. All of the three methods showed highly specific to C. scoparium. The sensitivities of the nested PCR and LAMP were much higher than the multiplex PCR. The sensitivity of multiplex PCR was also higher than regular PCR. C. scoparium could be detected within 60 min from infected Eucalyptus plants by LAMP, while at least 2 h was needed by the rest two methods. Using different Eucalyptus tissues as samples for C. scoparium detection, all of the three PCR-based methods showed much better detection results than regular PCR. Base on the results from this study, we concluded that any of the three PCR-based methods could be used as diagnostic technology for the development of efficient strategies of Eucalyptus dieback disease control. Particularly, LAMP was the most practical method in field application because of its one-step and rapid reaction, simple operation, single-tube utilization, and simple visualization of amplification products.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제38권5호
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• pp.347-355
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• 2023

본 연구에서는 시가독소 생성 대장균(STEC)을 검출하기 위해 식품공전의 polymerase chain reaction (PCR)검사법과 loop-mediated isothermal amplification (LAMP)를 비교하였다. PCR 및 LAMP의 검출 한계(LOD) 및 정량화 한계(LOQ), 민감도, 특이성 및 효율성을 평가하기 위해 다양한 식품에 STEC를 접종하였다. LOD는 PCR의 경우 10⁴ CFU/mL 이하, LAMP의 경우 10³ CFU/mL 이하로 측정되었다. LOQ 값은 PCR과 LAMP 간에 차이가 없었다. 그러나 4가지 식품군에서 민감도는 양념육이 최대 11.1%, 간소고기가 최소 8.1% 차이가 났다. LAMP는 네 가지 음식 유형 모두에 대해 높은 민감도와 100% 특이도를 보였다. 따라서 LAMP는 식품 유형에 따라 검출률이 비슷하고 특이도와 민감도가 식품공전 PCR보다 우수하기 때문에 STEC에 대한 신뢰할 수 있는 분자 검출 방법이다.

• 한국균학회지
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• 제26권4호통권87호
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• pp.466-477
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• 1998

진흙버섯류 22개 균주를 균총의 형태와 PCR 기법을 사용하여 종간의 구분 방법을 찾고자 하였다. PDA등 4가지 배지에서 균사생장 및 배지의 변색여부 등을 기준으로 특성을 구분할 때 목질진흙버섯의 균총 색깔은 진한 황색으로 균사생장이 늦고 배지를 푸르게 변색시켰다. rDNA 분석 결과 $ITSI{\sim}II$ 부위는 목질진흙버섯이 약 800 bp, 말똥진흙버섯은 약 700 bp였고, IGRI 부위는 목질진흙버섯은 약 700 bp, 말똥진흙버섯은 균주에 따라 약 500, 600, 700, 800 bp에서 4가지 각기 다른 밴드를 보였다. $ITSI{\sim}II$와 IGRI부위의 증폭된 DNA를 6개의 제한효소로 절단하여 다형성을 비교해 본 결과 $ITSI{\sim}II$의 HaeIII 절단으로 목질진흙버섯과 말똥진흙버섯을 구분할 수 있었으며 이들 밴드를 이용하여 유연관계를 조사한 결과 목질진흙버섯은 95%의 유사도를 보였으며, 말똥진흙버섯은 89%의 유사도로 complex를 형성하였다. 목질 진흙버섯은 RAPD 분석과 AP-PCR에 의한 밴드양상으로도 확실한 구분이 가능하였으며, $ITSI{\sim}II$ 부위의 HaeIII 제한효소 처리로 나타난 벤드는 이종의 특이적인 marker로 사용할 수 있을 것으로 본다.

• 한국균학회지
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• 제40권1호
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• pp.11-18
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• 2012

평택일원의 6개의 배 저장고로부터 300개의 부패된 배를 수집 하여 병반부위로부터 곰팡이를이분리 하여 조사한 결과 Penicillium 균이 이병배중에서 84%가 분리되었다. 84 Penicillium 균주를 대상으로 URP2R primer로 균주 간의 DNA 다양성을 조사한결과 18 type의 Penicillium 균주를 검출 할 수 있었으며 URP1F, URP2F, URP2R, URP4R의 PCR 다형성밴드를 이용한 유전적 유연관계분석으로 4 group으로 나눌 수 있었다. 18 Penicillium균주의 형태적특징을 조사한결과 3가지의 특징적인 배양적 특징을 갖는 것으로 확인 되었으며 포자형성과 포자형태에서도 3가지 type이 관찰 되었는데 SP-15균주 type, KP-1-1 균주 type, SP-17 type으로 PCR 다형성결과와 유사한 경향을 나타내었다. SP-15형은 형태적, rDNA의 ITS 염기서열 분석에서 P. expansum로 동정 되었으며 분리된 Penicillium 균주 중 70%를 차지하는 우점종인 것으로 나타났으므로 향 후 URP-PCR profile은 종간, 종내 계통 분류에 유용하게 이용 할 수 있다.

• 대한의생명과학회지
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• 제25권4호
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• pp.407-416
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• 2019

Recent years have seen an increase in the incidence of candidiasis caused by non-albicans Candida (NAC) species. In fact, C. glabrata is now second only to C. albicans as the most common cause of invasive candidiasis. Therefore, the rapid genotyping specifically for C. glabrata is required for early diagnosis and treatment of candidiasis. A number of genotyping assays have been developed to differentiate C. glabrata sequence types (STs), but they have several limitations. In the previous study, multi-locus sequence typing (MLST) has performed with a total of 101 C. glabrata clinical isolates to analyze the prevalent C. glabrata STs in Korea. A total of 11 different C. glabrata STs were identified and, among them, ST-138 was the most commonly classified. Thus, a novel probe-based quantitative PCR (qPCR) assay was developed and evaluated for rapid and accurate identification of the predominant C. glabrata ST-138 in Korea. Two primer pairs and hybridization probe sets were designed for the amplification of internal transcribed spacer 1 (ITS1) region and TRP1 gene. Analytical sensitivity of the probe-based qPCR assay was 100 ng to 10 pg and 100 ng to 100 pg (per 1 μL), which target ITS1 region and TRP1 gene, respectively. This assay did not react with any other Candida species and bacteria except C. glabrata. Of the 101 clinical isolates, 99 cases (98%) were concordant with MLST results. This novel probe-based qPCR assay proved to be rapid, sensitive, highly specific, reproducible, and cost-effective than other genotyping assay for C. glabrata ST-138 identification.