• 식물병연구
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• 제16권2호
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• pp.121-124
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• 2010

박과작물에 발생하는 종자전염 바이러스 3종(CGMMV, KGMMV, ZGMMV)에 대한 검출을 위해 IC-RT-PCR의 적용 가능성을 시험하였다. IC-RT-PCR을 이용하여 감염 종자와 잎으로 부터 바이러스의 특이적인 검출이 가능하였으며, 검출 민감도는 ELISA 보다 100배 이상 높았다. 또한 반응을 마친 ELISA 마이크로플레이트에 남아있는 항원을 IC-RT-PCR의 template로 사용할 경우 ELISA 결과를 곧바로 확인할 수 있었다. 따라서 IC-RT-PCR에 의한 본 검정방법은 박과작물의 대규모 포장검사 및 종자검사에 편리하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

• The Plant Pathology Journal
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• 제26권1호
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• pp.25-31
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• 2010

Papaya ringspot virus (PRSV) causes the most widespread and devastating disease in papaya. Isolates of PRSV originating from different geographical regions in south India were collected and maintained on natural host papaya. The entire coat protein (CP) gene of Papaya ringspot virus-P biotype (PRSV-P) was amplified by RTPCR. The amplicon was inserted into pGEM-T vector, sequenced and sub cloned into a bacterial expression vector pRSET-A using a directional cloning strategy. The PRSV coat protein was over-expressed as a fusion protein in Escherichia coli. SDS-PAGE gel revealed that CP expressed as a ~40 kDa protein. The recombinant coat protein (rCP) fused with 6x His-tag was purified from E.coli using Ni-NTA resin. The antigenicity of the fusion protein was determined by western blot analysis using antibodies raised against purified PRSV. The purified rCP was used as an antigen to produce high titer PRSV specific polyclonal antiserum. The resulting antiserum was used to develop an immunocapture reverse transcription-polymerase chain reaction (IC-RT-PCR) assay and compared its sensitivity levels with ELISA based assays for detection of PRSV isolates. IC-RT-PCR was shown to be the most sensitive test followed by dot-blot immunobinding assay (DBIA) and plate trapped ELISA.

• The Plant Pathology Journal
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• 제22권2호
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• pp.164-167
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• 2006

An immunocapture reverse transcription-polymerase chain reaction (IC/RT-PCR) was developed for simultaneous detection of two pepper-infecting RNA viruses, Pepper mud mottle virus (PMMoV) and Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV). The assay could be performed in a single tube for simultaneous and sensitive detection of these tobamoviruses. This detection system revealed thousand-fold increase in detection sensitivity compare to ELISA. This method could save time and reagent cost compare to common RT-PCR which needs several reactions and several procedures of viral RNA extractions for the same number of samples.

• 식물병연구
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• 제11권2호
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• pp.213-216
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• 2005

토마토 반점위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus; TSWV)가 2004년 경기도 안양지역에서 토마토, 고추 등을 포함한 14개 채소 작물에서 발생하였다. TSWV검정은 지표식물 검정, IC/RT-PCR, VC/RT-PCR 및 Total RNA를 이용한 RT-PCR방법을 이용하였으며, TSWV가 발생한 작물의 종류는 토마토, 방울 토마토, 고추, 시금치, 치커리, 적치커리, 적겨자, 용설채, 트레비소, 감자, 들깨, 참깨, 호박, 쌈추 이었다. 포장에서의 발생율은 토마토, 고추 등 주요 작물에서 $30\%$에서 $100\%$ 발생하였으며,병징은 대부분 전형적인 원형반점이었으며, 괴저, 위조 및 심한 모자이크 병징으로 진전되었다. TSWV가 발생한 포장에서 채집한 꽃노랑 총채벌레(Frankliniella occidentalis)를 IC/RT-PCR 검정한 결과 감염율이 $90\%$이었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제10권5호
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• pp.685-689
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• 2000

Due to the uncultivable nature of Mycobacterium leprae in vitro, the fast, easy, and accurate measurement of the antimicrobial drug susceptibility of this microbe has been difficult. Conventional methods for such testing are subjective, cumbersome, and expensive in some cases. Here, the utility of a reverse transcriptase-PCR (RT-PCR)-based assay for testing was examined and compared with a Buddmeyer-type radiorespirometric assay. The susceptibility of M. leprae to rifampin was determined by probing the presence of M.leprae-specific 18 kDa gene mRNA in M. leprae-infected IC-21 macrophage cells after drug treatment. The results showed that, as the refampin concentration was increased, the 360-bp cDNA products generated by the RT-PCR-based assay decreased in a dose-dependent manner as in the drug susceptibility observed in the Buddmeyer-type assay. The drug susceptibility testing of M. leprae by the RT-PCR based assay was found to be not only faster but also nearly $10^4$-fold more sensitive than the Buddmeyer-type assay. Moreover, it was also found that, unlike the RT-PCR based assay, the same testing by a DNA-PCR resulted in no differences in the 360-bp signal, regardless of the rifampin concentrations used. Accordingly, these results demonstrated that the drug susceptibility of M. leprae can be determined effectively by an RT-PCR-based assay, thereby providing a new, fast, and sensitive testing method.

• 한국가금학회지
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• 제37권2호
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• pp.167-172
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• 2010

닭 전염성 F낭병 (IBD)은 닭에서 전염성이 강하고 발병으로 인하여 양계 산업에 막대한 경제적 피해를 입히는 닭의 바이러스성 전염병이다. 이 연구에서는 수 분 이내에 검사 시료로부터 닭 전염성 F낭병 바이러스를 검출할 수 있는 시판용 면역크로마토그래피법 검사 킷트를 이용하여 IBD 진단에 있어서의 유용성을 조사하였다. 사용한 면역크로마토그래피법 검사 킷트는 닭 전염성 F낭병 바이러스 VP2에 특이적인 단클론 항체를 이용하여 닭 전염성 F낭병 바이러스를 검출하도록 고안되었다. 바이러스 감염 역가를 알고 있는 IBDV를 사용하여 조사한 결과, IC 검사 킷트의 검출 한계는 $10^{3.1}$ 내지 $10^{3.9}$ $EID_{50}$/mL이었다. 이 검사 킷트는 닭의 다른 전염성 바이러스인 뉴캣슬병 바이러스, 닭 전염성 기관지염 바이러스, 조류인플루엔자 바이러스 및 전염성 후두기관염 바이러스에 대하여 비특이 반응을 나타내지 않았다. 고병원성의 IBDV를 실험적으로 감염시킨 후 3일 내지 4일에 폐사한 닭의 장기별로 조사한 결과, 모든 폐사 닭의 F낭, 장편도, 비장, 신장 시료들은 면역크로마토그래피법 검사 킷트에서 강한 양성반응을 나타내었다. 검사 시료 중 F낭 시료가 IC 검사 킷트에서 가장 강한 양성반응을 나타내었다. 폐사 닭의 간, 흉선, 선위의 경우, 각각 검사시료의 87.5%, 37.5% and 0%가 양성 반응을 나타내었다. 면역크로마토그래피법 검사 킷트에서 음성이었던 시료 중 흉선 시료 한 점을 제외한 모든 시료는 DAS-ELISA와 동일한 검사 결과를 나타내었으나, 검사 시료 중 흉선과 선위 일부에서 RT-PCR 검사에서 양성 반응을 나타내었다. 야외 IBD 발생 농장과 비발생 농장에서 수거한 폐사닭 231수의 조직을 면봉으로 도말하여 채취한 시료를 조사하여 RT-PCR법과 비교한 결과, 상대적 민감도와 특이도는 각각 100% (109/109) 및 97.5% (119/122)를 나타났으며, 두 검사 방법간 kappa value는 0.97이었다. 우리의 연구 결과는 IC 검사 킷트는 야외 양계 농장에서 폐사 닭을 대상으로 IBD를 진단하는 데 적용하기에 매우 유용하다는 것을 말해준다.

• The Plant Pathology Journal
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• 제26권2호
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• pp.207-214
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• 2010

• 식물병연구
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• 제12권2호
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• pp.139-143
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• 2006

VC/RT-PCR은 바이러스의 단백질과 PCR 튜브의 재질적 특성을 이용하여 바이러스 이병주의 즙액으로부터 핵산을 지니고 있는 바이러스를 polypropylene에 부착시키고 그 외 PCR 활성을 저해하는 식물 즙액은 PBST로 제거해 주므로써 정확하고 깨끗한 바이러스 진단이 가능하다. 이 방법은 바이러스에 대한 항혈청이 전혀 필요 없으며 포장 시료를 직접 이용해 30 분 이내에 바이러스 핵산을 획득할 수 있어 바이러스 진단이 빠르고 간편하며 경제적이고 감도 높은 실용적인 방법이다. TSWV 에 대한 VC/RT-PCR을 위해 다양한 마쇄 완충액을 시험한 결과 0.5%의 Sodium sulphite를 포함한 0.01M Potassium phosphate (pH 7.0)가 가장 안정적이었으며 VC/RT-PCR을 이용하여 TSWV에 대한 최적의 처리 과정을 확립하였다. TSWV에 최적인 완충액에 마쇄한 바이러스 감염 잎의 조즙액을 이용한 한계 희석 농도는 $10^{-5}$으로 높은 감도를 보여 낮은 농도의 바이러스를 보유한 기주로부터 정확하 게 바이러스를 감지해 낼 수 있게 되었다. 두가지 이상의 바이러스에 감염된 기주로부터 두 가지 이상의 프라이머를 이용해 바이러스를 감지해 내는 다중 진단을 위한 실험 중 식물체의 종류와 바이러스의 Primer의 종류가 진단결과의 정확도에 큰 영향을 미치며 이러한 결과는 식물체 즙액을 바로 이용하는 VC/RT-PCR 방법은 물론 식물체로부터 Total RNA를 따로 분리하여 RT-PCR을 이용한 결과에서도 동일하게 나타났다. 따라서 편리하고 실용 적인 VC/RT-PCR법의 정확성을 최대화시키기 위해서는 다중 진단을 저해하는 식물체적 원인과 Primer 사이의 간섭 현상에 대한 연구가 더 진행될 것이며 이러한 원인을 충분히 제거해 줄 수 있는 마쇄 완충액을 개발하고 프라이머 제작을 더욱 신중히 해야 할 것이다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제22권12호
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• pp.1776-1781
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• 2012

Multiple viruses such as Lily symptomless virus (LSV), Lily mottle virus (LMoV), and cucumber mosaic virus (CMV) are the most prevalent viruses infecting lilies in Korea. Leaf samples and bulbs showing characteristic symptoms of virus infection were collected from Gangwon, Chungnam, and Jeju provinces of Korea in 2008-2011. Coat protein (CP) genes of LSV and LMoV were amplified from collected samples by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and cloned into a pET21d(+) expression vector to generate recombinant CPs. The resulting carboxy-terminal His-tagged CPs were expressed in Escherichia coli strain BL21(DE3) by isopropyl-1-thio-${\beta}$-D-galactoside induction. The recombinant proteins were purified using Ni-NTA agarose beads, and the purified proteins were used as an immunogen to produce polyclonal antibodies in rabbits. The resulting polyclonal antisera recognized specifically LSV and LMoV from infected plant tissues in Western blotting assays. Indirect enzymelinked immunosorbent assay and immunocapture RT-PCR using these polyclonal antisera were developed for the sensitive, efficient, economic, and rapid detection of Lily viruses. These results suggest that large-scale bulb tests and economic detection of Lily viruses in epidemiological studies can be performed routinely using these polyclonal antisera.

• 원예과학기술지
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• 제32권4호
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• pp.544-549
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• 2014

Lily symptomless virus (LSV), Lily mottle virus (LMoV), and Cucumber mosaic virus (CMV) are the most prevalent viruses infecting lilies in Korea. Leaf and bulb samples showing characteristic symptoms of virus infection were collected in 2012, and 80 field samples were analyzed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The infection frequencies were 79% for LMoV, 5% for LSV, and 3% for CMV. The LMoV coat protein gene was amplified and cloned into the pET21d(+) expression vector to develop serological diagnostic tools to detect LMoV. The resulting carboxy-terminal His-tagged coat proteins were expressed in Escherichia coli strain BL21 (DE3) by induction with IPTG. The recombinant proteins were purified using Ni-NTA agarose beads and used as an antigen to produce polyclonal antibodies in laying hens. The resulting egg yolk immunoglobulin (IgY) specifically recognized LMoV from infected plant tissues in immunoblotting assays and had comparable sensitivity to that of a mammalian antibody. In addition, method of immunocapture RT-PCR using this IgY was developed for sensitive, efficient, and rapid detection of LMoV. Based on these results, large-scale bulb tests and detection of LMoV in epidemiological studies can be performed routinely using this IgY. This is the first report of production of a polyclonal IgY against a plant virus and its use for diagnosis.