• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권3호
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• pp.269-272
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• 1989

In order to obtain monoclonal antibody from ascites fluid at sufficiently high purity using a single hydroxylapatite chromatography (HA) a further optimization on its operating variables was carried out. By adjusting the pH of the eluent, the sodium phosphate buffer, to 6.0 from 6.8 and adding CaCl$_2$to 1 mM at the column inlet, the elution molarities (M$_{elu}$) for the desired monoclonal antibody and contaminating proteins can be distinguished from each other with enough resolution. Previously these two groups of proteins co-eluted at the same time at pH 6.8 and without CaCl$_2$. This sin81e step hydroxylapatite chromatography yields the desired antibody pure enough for diagnostic use.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권1호
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• pp.19-23
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• 1989

생쥐 하이브리도마 세포를 주사한 생쥐의 복수로부터 대장암에 대한 단세포군 항체 IgM을 분리 정제해 내기 위하여 히드록실 아파타이트 크로마토그라피와 겔 여과 크로마토그라피를 연속적으로 사용하는 2단계 분리 정제 시스템을 개발하였다. 히드록실 아파타이트 크로마토그라피 단계에서는 단백질 밴드의 희석현상을 탈착제인 인산 나트륨 완충액의 농도구배와 유속을 제어함에 의하여 줄일 수 있었는 바 이들 변수들의 최적치는 5.92$\times$$10^{-3}$M/cm및 0.2$m\ell/\textrm{cm}^2$/min으로 각각 나타났다. 겔 여과 크로마토그라피를 제 2단계로 사용함으로 써 SDS-PAGE 밴드들의 은착색으로 판단된 바 99.99% 이상의 순도를 갖는 단세포군 항체 단백질을 분리 정제해 낼 수 있었다.

• BMB Reports
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• 제29권4호
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• pp.335-342
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• 1996

Porcine liver cysteinesulfinic acid decarboxylase was purified approximately 460-fold by means of ammonium sulfate fractionation and sequential column chromatographic separation with Sephadex G-100, DEAE-cellulose and hydroxylapatite. The enzyme has a flat pH profile with maximum activity occurring between pH 6.0 and 7.6. Pyridoxal 5'-phosphate must be present in all buffers used for purification procedures in order to stabilize the enzyme. Addition of sulfhydryl reagents such as 2-mercaptoethanol are also necessary to maintain maximum enzyme activity throughout purification. The absorption spectrum shows that cysteinesulfinic acid decarboxylase is a pyridoxal 5' -phosphate-containing protein. The major absorption is at 280 nm with two smaller absorption regions, one at 425 nm which is ascribed to a Schiffs base between pyridoxal phosphate and protein, and another at 325 nm which is thought to be due to the interaction of 2-mercaptoethanol with the Schiffs base. A number of divalent cations tested did not affect enzyme activity with the exception of mercury, copper, and zinc which are inhibitory. The partially purified enzyme has an apparent $K_m$ of 0.94 mM for cysteinesulfinate. Cysteic acid is a competitive inhibitor of the enzyme with a $K_i$ of 1.32 mM. The molecular weight of the enzyme was estimated to be about 79,600 by using Sephadex G-200 column chromatography.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제27권3호
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• pp.161-170
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• 1989

Toxeplasma의 추출액을 3H-casein을 기질로 반응시켰을 때, pH 6.0과 PH 8.5에서 casein을 분해하였으며, pH 6.0에서는 cysteinyl protease의 억제제 인 iodoacetamide(rAh)에 의해 억제되 었고, 활성제 인 dithiothreitol (DTT)에 의해 환성이 증가하였다. 또 pH 8.5에서는 serine protease의 억제제인 phenylmethylsulfonil fluoride (PMSF)에 의해 활성이 억제되었으며, ATP를 첨가할 때 그 활성이 증가하여 ATP 의존성 효소임을 알 수 있었다. 위의 단백질 분해 효소를 부분 정제하기 위해 여러 chromatography를 실시하였는데, 먼저 DE52 (2.Sfx40 cm)에 통과시켰을 때, 0.05M-0.IM NaCl에 의해 유출되는 분획이 pH 6.0에서 황성을 나타내었으며, 0.25V- 0.3M에서 유출되는 분획이 pH 8.5에서 황성을 나타내었다. 이 분회들을 각각 Sephadex G-200 ($2.50{\phi}{\times}40cm$) 에 통과시켜 pH 6.0에서 활성을 나타내는 분획은 exclusion limit내에서, pH 8.5의 분획은 exclusion limit 외에서 분획을 얻었다. 이들을 각각 hydroxylapatite ($2.50{\phi}{\times}10cm$과 $2.5{\phi}{\times}20cm$)를 통과시켜 각각을 0.05M Phosphate로 유출되는 분회에서 높은 환성을 얻었다. 부분 정제된 분획들의 특성을 검토하기 위하여 억제제를 농도별로 처리하였을 때, pH 0.0에서의 분해 효소는 10-3M IAA에 의해 활성이 반감되어 cysteinyl acid protease임을 알 수 있었다. pH 8.5에서의 분해 효소는 10-5M PMSF에 의해 활성이 반감되었고, ATP에 의해 활성이 증가(ATP의 농도가 2.0mM 이상에서는 억제)하여 ATP-dependent neutral serine protease임을 알 수 있었다.