• Journal of Ginseng Research
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• 제46권4호
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• pp.505-514
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• 2022

Background: The roots of Panax ginseng contain two types of tetracyclic triterpenoid saponins, namely, protopanaxadiol (PPD)-type saponins and protopanaxatiol (PPT)-type saponins. In P. ginseng, the protopanaxadiol 6-hydroxylase (PPT synthase) enzyme catalyses protopanaxatriol (PPT) production from protopanaxadiol (PPD). In this study, we constructed homozygous mutant lines of ginseng by CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of the PPT synthase gene and obtained the mutant ginseng root lines having complete depletion of the PPT-type ginsenosides. Methods: Two sgRNAs (single guide RNAs) were designed for target mutations in the exon sequences of the two PPT synthase genes (both PPTa and PPTg sequences) with the CRISPR/Cas9 system. Transgenic ginseng roots were generated through Agrobacterium-mediated transformation. The mutant lines were screened by ginsenoside analysis and DNA sequencing. Result: Ginsenoside analysis revealed the complete depletion of PPT-type ginsenosides in three putative mutant lines (Cr4, Cr7, and Cr14). The reduction of PPT-type ginsenosides in mutant lines led to increased accumulation of PPD-type ginsenosides. The gene editing in the selected mutant lines was confirmed by targeted deep sequencing. Conclusion: We have established the genome editing protocol by CRISPR/Cas9 system in P. ginseng and demonstrated the mutated roots producing only PPD-type ginsenosides by depleting PPT-type ginsenosides. Because the pharmacological activity of PPD-group ginsenosides is significantly different from that of PPT-group ginsenosides, the new type of ginseng mutant producing only PPD-group ginsenosides may have new pharmacological characteristics compared to wild-type ginseng. This is the first report to generate target-induced mutations for the modification of saponin biosynthesis in Panax species using CRISPR-Cas9 system.

• 한국작물학회:학술대회논문집
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• 한국작물학회 2022년도 추계학술대회
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• pp.191-191
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• 2022

Heterostyly continues to fascinate evolutionary biologists interested in heredity, evolution, breeding, and adaptive function. Polymorphism demonstrates how simply inherited developmental changes in the location of plant sexual associations can have important consequences for population pollination and mating biology. In contrast to homozygous self incompatibility, only a small number of mating phenotypes can be maintained in the population because insect pollinators have limitations in achieving multiple segregation sites for pollen deposition. Field studies of pollen tube growth have shown that reciprocal style-stamen polymorphisms function to increase the capacity of insect-mediated cross-pollination. The genetic pattern of style morphs is well established in various taxa, but despite recent advances, the identity, number, and structure of the genes controlling the heteromorphic syndrome have been poorly elucidated. The phenomenon of heterostyly in buckwheat has been controlled by gene complex concentrate to S-locus. Homomorphic autogamous buckwheat strains were established by the interspecific hybridization. Backcrossing of this line to the common buckwheat (pin) and selecting homostylar progenies made it possible to introduce the self-compatible gene into common buckwheat. In the result, we obtained the BC₉F₂ generation, and defined the strong linkage between flower type and self-incompatibility by microscopic observation of pollen tube growth. This finding suggests that self-incompatibility character is not controlled by one gene. Moreover, we defined the strong linkage between flower type and self-incompatibility. It strongly supports the S supergene theory. Therefore, we have plan to elucidate the heterostyly self-incompatibility by using molecular genetics, proteome analysis and apply to exploitation of buckwheat improvement. In near future, the expression of heterozygous syndromes in genus Fagopyrum with single isolated heterozygous species may provide clues to early stages of polymorphic assembly and shed light on evolutionary models of heterozygous strains.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제32권1호
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• pp.37-44
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• 2005

고추의 나출 소포자로부터 배를 유기하는데 최적인 조건을 확립하기 위하여 micro-blender를 사용하여 소포자들을 나출한 후 NLN 배지에 배양하였으며 $32^{\circ}C$의 고온처리 기간, 전처리 배지내 2-hydroxynicotinic acid의 첨가, 그리고 약과 소포자의 공동전처리가 소포자배의 발생에 미치는 영향을 조사하였다. 나출 소포자들을 기아배지에서 고온처리 한 후 NLN 배지에 배양하였을 때 다수의 배가 발생하였다. 배양 3주 후부터 구형 및 어뢰형배가 관찰되었는데 이때 배의 발생은 비동조적으로 일어났다. 배양4주가 되면 구형과 어뢰형배 이외에 자엽배들이 발생하였다. 발생한 배들 중자엽배늘은 $2\%$ sucrose가 첨가되고 생장조절물질은 첨가되지 않은 B5 고체배지로 옮겼을 때 정상인 유식물들로 발달하였다. 고온처리 기간이 $1\~2$일로 짧은 경우 소포자배의 발생은 높았으나 대부분이 발달초기의 구형 또는 심장형배이었으며 자엽배의 발생은 매우 드물었다. 고온처리 3일 이상에서는 배의 발생은 크게 감소하였으나 자엽배가 다수 발생하였다. Inducer chemical로 알려진 2-hydroxynicotinic acid를 약전처리배지에 첨가하였을 때 배의 발생은 다소 높았으나 발달은 오히려 억제되어 대부분이 구형 또는 심장형이었다. 소포자 전처리시 약을 첨가한 경우 배의 발생이나 발달 모두 억제되었다. 본 연구결과 고추의 나출 소포자로부터 다수의 배를 획득하였고 식물체를 재분화 시키는데 처음으로 성공하였다. 이와 같은 소포자 배양시스템은 앞으로 더 많은 배를 생산할 수 있는 배양조건이 확립되어야 하지만 homozygous한 배가 반수체의 생산 뿐만아니라 형질 전환과 열성 또는 우성의 돌연변이체 선발에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 비해 $ 0.27\~0.79\;\cal{mg/g}$ F.W.가 높았으며 환기횟수 $0.1 h^{-1}$ 처리구는 광도의 증가에 따른 효과가 나타나지 않았으나 환기횟수 $0.1 h^{-1}$ 처리구는 높은 광도에서 감소하였다. 환기횟수 $4.9 h^{-1}$는 $0.1 h^{-1}$에 비해 잎의 공변세포가 크고 주변 부세포가 잘 발달되어 있었다. 특히 PPF $99\;{\mu}mol\;m^{-2}s^{-1}$에서 환기횟수 $0.1 h^{-1}$는 부세포의 발달이 미흡하고 기공이 많이 열려 있는 상태인 반면 환기횟수 $4.9 h^{-1}$는 부세포가 잘 발달된 잎을 지니고 있었다.:PR30, KB50:PR50, PR100:KB0 처리구의 $1m^2$ 당 개체 수는 각각 16,600개, 6,700개, 4,900개, 3,300개, 12,400개였으며 총직립경 수는 각각 33,200개, 22,800개, 18,000개, 15,000개, 62,000개였다. 개체 수는 KB100:PR0처리구가 가장 높았고, 다음은 PR100:KB0처리구였으며 혼합처리구의 경우는 Kentucky bluegrass 혼합비 율이 높을수록 높았다. 총직립경 수는 PR100:KB0 처리구가 KB100:PR0 처리구보다 오히려 높았으며 혼합 처리구의 경우는 개체수와 비슷한 경향을 보였다. 혼합처리구의 경우 초종별 개체수의 비율은 KB80:PR20는 87:13, KB70:PR30는 78:22, KB50:PR50은 48:52의 비율로 나타났다. 조성시기의 기상과 피복율과의 상관관계 2001년 가을과 2002년 봄의 일일평균기온을 비교하여 보면 가을(9월, 10월, 11월) 3개월간의 일일평균기온은

• 한국식물학회:학술대회논문집
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• 한국식물학회 1996년도 제10회 식물생명공학심포지움 고등식물 발생생물학의 최근 진보
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• pp.61-74
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• 1996

Human and monogastric animals can not synthesize 10 out of the 20 amino asids and therefor need to obtain these from their diet. The plant seed is a major source of dietary protein. It is particular important in their study to increase nutritional quality of the seed storage proteins. The low contents of lysine, asparagine and threonenein various cereal seeds and of cystein and methionine. In legume seeds is due to the low proportions of these amino acids in the major storage proteins, we have tried to apply the three strategies; (1) mutagenesis and selection of specific amino acid analogue resistance, (2) cloning and expression study of lysine biosynthesis related gene, (3) transfomation of lysine rich soybean glycinin gene. The 5-methyltryptophan (5MT) resistant cell lines, SAR1, SAR2 and SAR3 were selected from anther derived callus of rice (Oryza sativa L. "Sasanishiki"). Among these selected cell lines, two (SAR1 and SAR3) were able to grow stably at 200 mg/L of 5MT. Analysis of the freed amino acids in callus shows that 5MT resistant cells (SAR3) accumulated free tryptophan at least up to 50 times higher than those that of the higher than of SAS. These results indicated that the 5MT resistant cell lines are useful in studies of amino acid biosynthesis. Tr75, a rice (Oryza sativa L., var. Sasanishiki) mutant resistant to 5MT was segregated from the progenies of its initial mutant line, TR1. The 5MT resistant of TR75 was inherited in the M8 generations as a single dominant nuclear gene. The content of free amino acids in the TR75 homozygous seeds increased approximately 1.5 to 2.0 fold compared to wild-type seeds. Especially, the contents of tryptophan, phenylalanine and aspartic acid were 5.0, 5.3 and 2.7 times higher than those of wild-type seeds, respectively. The content of lysine is significantly low in rice. The lysine is synthesized by a complex pathway that is predominantly regulated by feedback inhibition of several enzymes including asparginase, aspatate kinase, dihydrodipicolinat synthase, etc. For understanding the regulation mechanism of lysine synthesis in rice, we try to clone the lysine biosynthetic metabolism related gene, DHPS and asparaginase, from rice. We have isolated a rice DHPS genomic clone which contains an ORF of 1044 nucleotides (347 amino acids, Mr. 38, 381 daltons), an intron of 587 nucleotides and 5'and 3'-flanking regions by screening of rice genomic DNA library. Deduced amino acid sequence of mature peptide domain of GDHPS clone is highly conserved in monocot and dicot plants whereas that of transit peptide domain is extremely different depending on plant specie. Southern blot analysis indicated that GDHPS is located two copy gene in rice genome. The transcripts of a rice GDHPS were expressed in leaves and roots but not detected in callus tissues. The transcription level of GDHPS is much higher in leaves indicating enormous chloroplast development than roots. Genomic DNA clones for asparaginase genes were screened from the rice genomic library by using plaque hybridization technique. Twelve different genomic clones were isolated from first and second screening, and 8 of 12 clones were analyzed by restriction patterns and identified by Southern Blotting, Restriction enzyme digestion patterns and Southern blot analysis of 8 clones show the different pattern for asparaginase gene. Genomic Southern blot analysis from rice were done. It is estimated that rice has at least 2-3 copy of asparaginase gene. One of 8 positive clones was subcloned into the pBluescript SK(+) vector, and was constructed the physical map. For transformation of lysine rich storage protein into tobacco, soybean glycinin genes are transformed into tobacco. To examine whether glycinin could be stably accumulated in endosperm tissue, the glycinin cDNA was transcriptionally fused to an endosperm-specific promotor of the rice storage protein glutelin gene and then introduced into tobacco genomic via Agrobacterium-mediated transformation. Consequently the glycinin gene was expressed in a seed-and developmentally-specific manner in transgenic tobacco seeds. Glycinin were targeted to vacuole-derived protein bodies in the endosperm tissue and highly accumulated in the matrix region of many transgenic plant (1-4% of total seed proteins). Synthesized glycinin was processed into mature form, and assembled into a hexamer in a similar manner as the glycinin in soybean seed. Modified glycinin, in which 4 contiguous methionine residues were inserted at the variable regions corresponding to the C - teminal regions of the acidic and basic polypeptides, were also found to be accumulated similarly as in the normal glycinin. There was no apparent difference in the expression level, processing and targeting to protein bodies, or accumulation level between normal and modified glycinin. glycinin.

• 한국작물학회지
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• 제67권4호
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• pp.265-273
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• 2022

본 연구는 국립식량과학원에서 고품질 내재해성 찰옥수수 품종 개발을 위해 육성한 177개의 흰찰옥수수, 노랑찰옥수수, 검정찰옥수수 자식계통을 이용하여 16개 농업형질에 대해 평가하여 우수 계통 선발 및 품종 개방을 위한 기초 자료로 이용하고자 수행하였다. 1. 흰찰옥수수, 노랑찰옥수수, 검정찰옥수수 자식계통의 16개 농업형질을 조사한 결과 전체 계통의 평균 출웅일수는 77.69±2.22일, 출사일수 81.12±7.56일, 초장 164.88±22.67 cm, 간장 124.61±24.62 cm, 착수고율 49.34±9.08%, 옆폭 7.53±1.45 cm, 이삭길이 11.75±2.52 cm, 이삭폭 2.94±0.68 cm, 이삭열수 12.22±2.22열, 종자길이 7.75±1.08 mm, 종자너비 7.42±0.68 mm, 종자두께 5.06±0.68 mm, 이삭착립장 11.79±2.13 cm, 열당 종자수 24.30±4.22립, 조단백질 12.05±1.53%, 총 전분 69.27±5.74%로 조사되었다. 2. 16개 농업형질 간의 상관관계 분석결과 출웅일수와 출사일수 간의 상관관계가 0.896으로 가장 높게 나타났다. 초장과 간장 간의 상관관계가 0.740로, 이삭착립장과 이삭 열당 종자수도 0.675로 상관관계가 다음으로 높았다. 3. 주성분 분석 결과 16개의 농업형질 중에서 이삭폭, 종자길이, 이삭길이, 출웅일수, 출사일수, 착수고율, 총 전분이 177개 옥수수 자식계통을 식별하는데 유용한 형질들인 것으로 나타났다. 4. 계층 군집분석을 통해 초장이 크고 동시에 출사일수가 짧은 흰찰 자식계통 7개(KW34, KW37, KW83, KW84, KW100, KW103), 검정찰 자식계통 1개(KBW33), 노랑찰 자식계통 4개(KY11, KY23, KY26, KY34)를 선발하였다. 이 계통들은 수량성이 높은 조생종 찰옥수수 품종을 개발하는데 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

• 한국육종학회지
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• 제43권5호
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• pp.413-421
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• 2011

본 연구에서는 관행의 교배육종과 DNA 마커를 이용한 MAS의 접목을 통하여 벼멸구 저항성과 관련된 단점을 보완하고, 효율적으로 도열병, 줄무늬잎마름병, 흰잎마름병, 벼멸구, 끝동매미충 저항성이 집적된 복합내병충성 우량계통을 육성하고자 수행하였다. 교배모본으로는 완전미율이 높고, 끝동매미충에 저항성인 '남평'과 단간이면서 흰잎마름병에 저항성인 '주남'을 반복친으로 사용하였고, 벼멸구저항성 유전자 Bph1을 가지고 있지만 간장이 크고 재배안전성이 미흡한 '밀양220호'를 공여친으로 사용하였다. 벼멸구 저항성 연관마커 RM28493을 이용하여 $BC_1F_1$ 및 $BC_2F_1$ 세대에서 MAS로 저항성 개체 선발과 여교잡을 수행하였으며, 복교잡 $F_1$ 세대에서 MAS를 통한 벼멸구 저항성이 고정된 계통을 선발하였다. 고세대 계통에서 생물검정을 통하여 흰잎마름병, 끝동매미충에 저항성인 계통을 선발하였다. MAS와 생물검정을 통해 도열병, 흰잎마름병, 줄무늬잎마름병, 벼멸구 및 끝동매미충에 저항성인 85개의 복합내병충성계통을 선발하였다. 복합내병충성 계통의 간장, 완전미율 및 수량은 각각 71~88 cm, 51~93%, 449~629 kg/10a 사이에 분포하였다. 복합내충성계통중 간장, 완전미율 및 수량이 남평벼와 비슷한 계통을 선발하여 '밀양265호'로 명명하였다. 최종적으로 본연구에서는 기존의 교배육종과 분자육종의 접목을 통하여 복합내병충성 우량계통을 육성하였으며, 이는 금후 유용교배모본으로 활용될 것으로 기대된다.

• 한국육종학회지
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• 제50권4호
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• pp.463-471
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• 2018

들깨는 우리나라에서 재배되어온 대표적인 유지작물로 지질의 함량 중 알파리놀렌산의 함량이 60% 전후로 불포화도가 높아서 산패가 쉽게 일어나는 문제가 있다. 알파리놀렌산은 소포체 유래의 ${\Delta}15$ desaturase (FAD3)와 엽록체 유래의 ${\Delta}15$ desaturase (FAD7)에 의해서 합성된다. 엽록체 유래의 FAD7 유전자 발현의 손상없이 종자의 알파리놀렌산 함량을 낮추기 위해 소포체 유래 FAD3 유전자를 RNAi기법을 이용하여 발현을 억제하였다. 재배종인 엽실들깨의 배축을 이용하여 아그로박테리움 매개 형질전환법으로 제초제(바스타) 저항성을 가진 형질전환체 17개체를 획득하였다. 형질전환체는 0.3% (v/v) 바스타제초제를 이용하여 선발하였으며 Northern blot으로 FAD3 유전자의 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 온실에서 수확한 12개체 종자 지방산 함량을 분석한 결과 알파리놀렌산 함량이 10-20% 2개체, 30-40% 7개체, 대조구와 비슷한 60%대 3개체를 획득하였다. 형질전환체의 $T_2$ 종자의 분리비와 지방산 조성을 분석한 결과 동형접합체 계통에서 6-10% 알파리놀렌산 함량을 보였으며 이형접합계통은 20-26% 알파리놀렌산 함량을 나타내어 동형으로 고정시 FAD3 유전자 발현이 상당히 강력히 억제됨을 확인할 수 있었다. 들기름의 지방산 중 알파리놀렌산 함량의 감소는 들깨의 산패를 방지하고 감마리놀렌산 등의 고가의 건강기능성 지방산 생산에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.