Nierode, Gregory;Kwon, Paul S.;Dordick, Jonathan S.;Kwon, Seok-Joon
Journal of Microbiology and Biotechnology
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v.26
no.2
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pp.213-225
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2016
To reduce attrition in drug development, it is crucial to consider the development and implementation of translational phenotypic assays as well as decipher diverse molecular mechanisms of action for new molecular entities. High-throughput fluorescence and confocal microscopes with advanced analysis software have simplified the simultaneous identification and quantification of various cellular processes through what is now referred to as high-content screening (HCS). HCS permits automated identification of modifiers of accessible and biologically relevant targets and can thus be used to detect gene interactions or identify toxic pathways of drug candidates to improve drug discovery and development processes. In this review, we summarize several HCS-compatible, biochemical, and molecular biology-driven assays, including immunohistochemistry, RNAi, reporter gene assay, CRISPR-Cas9 system, and protein-protein interactions to assess a variety of cellular processes, including proliferation, morphological changes, protein expression, localization, post-translational modifications, and protein-protein interactions. These cell-based assay methods can be applied to not only 2D cell culture but also 3D cell culture systems in a high-throughput manner.
Inhalational anthrax is caused by B. anthracis, a virulent sporeforming bacterium which secretes anthrax toxins consisting of protective antigen (PA), lethal factor (LF) and edema factor (EF). LF is a Zn-dependent metalloprotease and is the main determinant in the pathogenesis of anthrax. Here we report the identification of a lead small-molecule inhibitor of anthrax lethal factor by screening an available synthetic small-molecule inhibitor library using fluorescence-based high-throughput screening (HTS) approach. Seven small molecules were found to have inhibitory effect against LF activity, among which SM157 had the highest inhibitory activity. All theses small molecule inhibitors inhibited LF in a noncompetitive inhibition mode. SM157 and SM167 are from the same family, both having an identical group complex, which is predicted to insert into S1' pocket of LF. More potent small-molecule inhibitors could be developed by modifying SM157 based on this identical group complex.
Kim, Eun-Hye;Lee, Sunghoon;Park, Jongsun;Lee, Kyusang;Bhak, Jong;Kim, Byung Chul
Genomics & Informatics
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v.12
no.2
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pp.50-57
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2014
We present a new next-generation sequencing-based method to identify somatic mutations of lung cancer. It is a comprehensive mutation profiling protocol to detect somatic mutations in 30 genes found frequently in lung adenocarcinoma. The total length of the target regions is 107 kb, and a capture assay was designed to cover 99% of it. This method exhibited about 97% mean coverage at $30{\times}$ sequencing depth and 42% average specificity when sequencing of more than 3.25 Gb was carried out for the normal sample. We discovered 513 variations from targeted exome sequencing of lung cancer cells, which is 3.9-fold higher than in the normal sample. The variations in cancer cells included previously reported somatic mutations in the COSMIC database, such as variations in TP53, KRAS, and STK11 of sample H-23 and in EGFR of sample H-1650, especially with more than $1,000{\times}$ coverage. Among the somatic mutations, up to 91% of single nucleotide polymorphisms from the two cancer samples were validated by DNA microarray-based genotyping. Our results demonstrated the feasibility of high-throughput mutation profiling with lung adenocarcinoma samples, and the profiling method can be used as a robust and effective protocol for somatic variant screening.
Melanin concentrating hormone is a neuropeptide highly expressed in the brain that regulates several physiological functions mediated by receptors in the G-protein coupled receptor family, especially plays an important role in the complex regulation of energy balance and body weight mediated by the melanin concentrating hormone receptor subtype 1 (MCH1). Compelling pharmacological evidence implicating MCH1 signaling in the regulation of food intake and energy expenditure has generated a great deal of interest by pharmaceutical companies as MCH1 antagonists may have potential therapeutic benefit in the treatment of obesity and metabolic syndrome. Although fluorescence-based calcium mobilization assay platform has been one of the most widely accepted tools for receptor research and drug discovery, fluorescence interference and shallow assay window limit their application in high throughput screening and have led to a growing interest in alternative, luminescence-based technologies. Herein, a luminescence-based functional assay system for the MCH1 receptor was developed and validated with the mitochondrial targeted aequorin. Aequorin based functional assay system for MCH1 presented excellent Z' factor (0.8983) and high signal-to-noise ratio (141.9). The nonpeptide MCH1 receptor antagonist, SNAP 7941 and GSK 803430, exhibited $IC_{50}$ values of 0.62 ${\pm}$ 0.11 and 12.29 ${\pm}$ 2.31 nM with excellent correlation coefficient. These results suggest that the aequorin based assay system for MCH1 is a strong alternative to the traditional GPCR related tools such as radioligand binding experiments and fluorescence functional determinations for the compound screening and receptor research.
As a rapid and quick bioactive compound evaluation technique, we utilized an automatic system of high throughput screening (HTS) to investigate ${\alpha}$-glucosidase inhibitory efficacy of seaweeds, collected from Jeju Island in Korea. In this study, different extracts with methanol at $20^{\circ}C$ and $70^{\circ}C$ from 23 species of brown seaweeds and 22 species of red seaweeds and 9 species of green seaweeds were subjected to HTS. Of the brown seaweeds tested, Myelophycus simplex (20B3), Ishige sinicola (20B5, 70B5), Colpomenia sinuosa, (20B14, 70B14), Hizikia fusiforme (20B21), Ishige okamurai (70B22) and Ecklonia cava (70B23) showed significantly high ${\alpha}$-glucosidase inhibitory activity with 96.52%, 98.34%, 98.37%, 80.49%, 96.16%, 76.32%, 98.32% and 98.12%. Schizymenia dubyi (20R15), Gelidium amansii (20R16) and Polysiphonia japonica (70R22) amomng the red seaweeds showed remarkable ${\alpha}$-glucosidase inhibitory activity more than 95%. On the other hand, the green seaweeds showed poor ${\alpha}$-glucosidase inhibitory activities (less the10%) at 1 mg/ml.
Metabolomics which deals with the biological metabolite profile produced in the body and its relation to disease state is a relatively recent research area for drug discovery and biological sciences including toxicology and pharmacology. Metabolomics, based on analytical method and multivariate analysis, has been considered a promising technology because of its advantage over other toxicogenomic and toxicoproteomic approaches. The application of metabolomics includes the development of biomarkers associated with the pathogenesis of various diseases, alternative toxicity tests, high-throughput screening (HTS), and risk assessment, allowing the simultaneous acquisition of multiple biochemical parameters in biological samples. The metabolic profile of urine, in particular, often shows changes in response to exposure to xenobiotics or disease-induced stress, because of the biological system's attempt to maintain homeostasis. In this review, we focus on the most recent advances and applications of metabolomics in toxicological research.
MicroRNAs are non-coding short (~23 nucleotides) RNAs that mediate post-transcriptional regulation through sequence-specific gene silencing. The role of miRNAs in neuronal development, synapse formation and synaptic plasticity has been highlighted. However, the role of neuronal activity on miRNA regulation has been less focused. Neuronal activity-dependent regulation of miRNA may finetune gene expression in response to synaptic plasticity and memory formation. Here, we provide an overview of miRNA regulation by neuronal activity including high-throughput screening studies. We also discuss the possible molecular mechanisms of activity-dependent induction and turnover of miRNAs.
In recent years, high-throughput genome-wide RNA interference screening is emerging as an essential tool to biologists in understanding complex cellular processes. The manual analysis of the large number of images produced in each study spends much time and the labor. Hence, automatic cellular image analysis becomes an urgent need, where segmentation is the first and one of the most important steps. However, those factors such as the region overlapping, a variety of shapes, and non-uniform local characteristics of cellular images become obstacles to efficient cell segmentation. To avoid the problem, a new watershed-based cell segmentation algorithm using a localized segmentation method and a feature vector is proposed in this paper. Localized approach in segmentation resolves the problems caused by a variety of shapes and non-uniform characteristics. In addition, the poor performance of segmentation in overlapped regions can be improved by taking advantage of a feature vector whose component features complement each other. Simulation results show that the proposed method improves the segmentation performance compared to the method in Cellprofiler.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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