• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제12권6호
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• pp.1002-1005
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• 2002

The effects of GroEL/ES chaperone on the production of soluble form of B. macerans cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) in recombinant E. coli were investigated. The cgt gene and groEL/ES genes are under the control of T7 promoter and Pzt-1 promoter, respectively. The optimal concentrations of inducers, IPTG and tetracycline, were found to be 1.0 mM and 10 ng/ml, respectively. When tetracycline and IPTG were added at the early exponential phase (2h) and exponential phase (3h) of growth, respectively, about 1.5-fold increase of soluble CGTase activity and 1.6-fold increase of soluble CGTase protein were obtained. An SDS-PAGE analysis revealed that about $37.2\%$ of total CGTase protein was in the soluble fraction when GroEL/ES chaperone was overexpressed.

• 생명과학회지
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• 제12권6호
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• pp.688-693
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• 2002

Chaperone 분자는 세포 내에서 새로 합성된 polypeptides의 misfolding을 보호하는 역할을 가진다. 이런 chaperone 분자와의 공발현은 활성형 재조합 단백질의 생산을 증가를 기대할 수 있다. 본 연구에서는 E. cozi에서 B. macerans 유래 cyclodextrin glucanotransferase (CGTase)의 활성형 생산에 GroEL/ES chaperone과의 공발현의 효과에 대해 조사하였다. cgt와 groEL/ES 유전자출 발현하는 pTCGT1과 pGro7은 각각 T7 promoter와 araB promoter에 의해 조절되고 이들을 E. coli cell에 co-transformation시켰다. 재조합 E. coli에서 IPTG와 L-arabinose의 최적 농도를 결정하기 위해 행한 결과 1 mM IPTG, 0.3 mg L-arabinose/$m\ell$에서 가장 높은 CGTase 활성을 나타내었다. 그리고 tube에서는 L-arabinose와 IPTG를 각각 0.4~0.5 $OD_{600}$과 0.8~l.0 $OD_{600}$에서 첨가하였을 때 활성형 CGTase의 생산이 증가되었다. GroEL/ES 공발현 조건에서는 가용성 CGTase 활성이 0.7~0.73 unit/$m\ell$로 단독 발현의 0.36~0.56 unit/$m\ell$에 비해 약 1.5 배 정도 증가함을 알 수 있었다. SDS-PAGE 분석에서는 GroEL/ES 공발현 조건에서 총 CGTase의 33.6%정도가 가용성 형태로 생산됨을 알 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제17권2호통권82호
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• pp.211-217
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• 2007

이 연구의 목적은 대장균 분자 샤페론 GroEL의 시험관 내 단백질 접힘에 있어서 반응온도의 영향과 보조샤페론의 필요 여부를 자발적 재접힘이 가능한 온도와 그렇지 않은 온도조건에서 조사하는 것이다. 여러 조건하에서 GroEL에 의한 두 가지 기질 단백질의 재접힘을 반응속도론적으로 조사하기 위하여 GroEL에 의한 단백질 침전생성억제와 변성된 단백질의 재접힘을 광범위하게 조사하였다. 자발적 재접힘이 가능하지 않은 $37^{\circ}C$에서는 ATP와 완전한 GroEL 시스템이 변성된 폴리펩티드의 재접힘을 위하여 필요하다는 것을 확인하였다. 하지만, 자발적 재접힘이 가능한 낮은 온도에서는 자발적 재접힘과 샤페론 의존적 단백질 재접힘이 서로 경쟁하는 것을 알 수 있었다. 따라서 GroEL은 변성된 폴리펩티드의 자발적 접힘 경로를 더 효율적인 단백질 재접힘 경로인 샤페론 의존적 단백질 재접힘 경로로 유도하는 것으로 보인다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제14권1호
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• pp.216-219
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• 2004

The effect of culture temperature on the production of soluble form of B. macerans cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) in recombinant E. coli was investigated. E. coli cell was cotransformed with two plasmids (pTCGT1 and pGroll) in which the cgt and groEL/ES genes are under the control of T7 promoter and pzt-1 promoter, respectively. When tetracycline (10 ng/ml) and IPTG (l mM) were added as inducers at the early-exponential phase (2 h) and mid-exponential phase (3h), respectively, the solubilization of the inclusion body CGTase was greatly dependent on the temperature of the culture. At low culture temperature of $25^\circ{C}$, 2- or 3-fold higher activity and specific activity were obtained over $37^\circ{C}$. SDS-PAGE analysis revealed that about 62% of CGTase in the total CGTase protein was found in the soluble fraction by applying overexpression of GroEL/ES chaperone and by cultivation of E. coli at $25^\circ{C}$, whereas 33% of CGTase was detected in the soluble fraction at $37^\circ{C}$. Therefore, the expression of GroEL/ES and cultivation at $25^\circ{C}$ greatly enhanced the soluble production of CGTase in E. coli.

• KSBB Journal
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• 제23권5호
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• pp.403-407
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• 2008

본 연구에서는 현재 산업적 응용이 활발하게 이루어지고 있고, 여러 장점을 지닌 효소인 Candida antarctica에서 유래된 lipase B (CalB)의 신속한 개질을 위해 취급이 용이한 E. coli를 이용하여 CalB 발현시스템을 구축하였다. E. coli 발현 시스템에서 효소활성을 지니지 못하는 내포체를 생성하는 단점을 지니고 있어, soluble한 형태의 CalB 생성을 위해 저온 발현이 가능한 pCold I vector와 단백질 접힘을 도와주는 chaperone을 사용하여 CalB를 발현하였다. Liu 등(17)은 E. coli Origami2와 B, 그리고 $DH5{\alpha}$를 실험한 결과, Origami 균주에서만 CalB에 의한 halo의 형성이 관찰되었으나, 동 연구에서는 실험한 3종의 균주와 5종의 chaperone plasmid중 Rosettagami와 $DH5{\alpha}$에서 groES/groEL chaperone이 CalB와 동시에 발현되면 soluble한 형태의 Cal B가 발현됨을 관찰할 수 있었다. 또한 신속한 CalB의 발현시스템을 구축하기 위해서는 유전자 조작의 용이성 및 안정성에서 우월한 $DH5{\alpha}$가 Rosettagami에 비해 soluble한 CalB의 발현에 더욱 적합한 균주임이 관찰되었다. 즉 재조합 pCold plasmid와 pGro7 plasmid (groES/groEL)로 형질이 전환된 $DH5{\alpha}$가 CalB 발현시스템에 가장 적합하다.

• 생명과학회지
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• 제14권1호
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• pp.121-125
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• 2004

E. coli에서 B. macerans 유래 cyclodextrin glucanotransferase (CGTase)의 활성형 생산에 GroEL/ES chaperone과의 공발현과 저온 배양의 공동작용 효과에 대해 조사하였다. 실험에 사용된 cgt와 groEL/ES 유전자를 발현하는 pTCGTl과 pGroll은 각각 T7 promoter와 Pzt-1 promoter에 의해 조절되고 이들을 E. coli에 도입시켰다. 대수증식기 초기(2 hr)와 대수증식기 중기(3 hr)에 tetrarycline 10 ng/ml 과 IPTG 1 mM을 첨가하여 각각의 유전자를 발현시켰다. CGTase활성과 specific artivity 측정 시 $37^{\circ}C$에서 pTCGTl 단독 발현 보다 $25^{\circ}C$에서 chaperone과 함께 발현시킨 경우 2배나 높은 활성이 측정됐으며, SDS-PACE 분석결과 $37^{\circ}C$에서 단독 발현 시킬경우 20% 정도 가용성 형태로 발현되던 것이 $25^{\circ}C$에서 chaperone과 공발현 시에는 거의 3.5배가 넘는 69%가 가용성으로 전환됨을 알 수 있었다. 이와 같이 분자 chaperone과 $25^{\circ}C$에서의 저온 배양은 E. coli에서 활성형질 가용성 CGTase의 생산 증가에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제15권6호
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• pp.1267-1272
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• 2005

The effects of coexpression of GroEL/ES and DnaK/DnaJ/GrpE chaperones on the productivity of the soluble form of human granulocyte colony stimulating factor (hG-CSF) in E. coli were examined. Recombinant hG-CSF protein was coexpressed with DnaK/DnaJ/GrpE or GroEL/ES chaperones under the control of the araB or Pzt-1 promoter, respectively. The optimal concentration of L-arabinose for the expression of DnaK/DnaJ/GrpE was found to be 1 mg/ml. When L-arabinose was added at $OD_{600}$=0.2 (early-exponential phase), soluble hG-CSF production was greatly increased. In addition, it was observed that the DnaK/DnaJ/GrpE and GroEL/ES chaperones had no synergistic effects on preventing aggregation of hG-CSF protein. Consequently, by coexpression of the DnaK/DnaJ/GrpE chaperone, the signal intensity of the hG-CSF protein band in the soluble fraction of cell lysate was increased from $3.5\%\;to\;13.9\%$, and Western blot analysis also revealed about a 4-5-fold increase of production of soluble hG-CSF over the non-induction case of DnaK/DnaJ/GrpE.

• 한국미생물생명공학회:학술대회논문집
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• 한국미생물생명공학회 2001년도 Proceedings of 2001 International Symposium
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• pp.62-72
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• 2001

The N-carbamoyl-D-amino acid amidohydrolase (D-carbamoylase) gene (dcb) from Agrobacterium tumefaciens AM 10 has been successfully cloned and expressed in Escherichia coli. Expression of D-carbamoylase gene under the 17 promoter in different host strains showed that the optimal expression was achieved in E. coli JM109 (DE3) with a 9-fold increase in enzyme production compared to the wild-type strain. The co-expression of the GroEL/ES protein with D-carbamoylase protein caused an in vivo solubilization of D-carbamoylase in an active form. The synergistic effect of GroEL/ES at 28$^{\circ}C$ led to 60 ％ solubilization of the total expressed target protein with a 6.2-fold increase in enzyme activity in comparison to that expressed without GroEL/ES and 43-fold increase in enzyme activity compared to A. tumefaciens AM 10. Attempts to express D-carbamoylase in an altered redox cytoplasmic milieu did not improve the enzyme production in an active form. The Histidyl-tagged D-carbamoylase was purified in a single step by Nickel-affinity chromatography and was found to have a specific activity of 9.5 U/mg protein.

• 한국자기공명학회논문지
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• 제17권1호
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• pp.30-39
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• 2013

Immortalization-upregulated protein-1 (IMUP-1) genes have been cloned and are known to be involved in SV40-mediated immortalization. IMUP-1 gene is highly expressed in various cancer cell lines and tumors, suggesting the possibility that they might be involved in tumorigenicity. Previously, there were several problems for overexpression of IMUP-1 in bacterial expression systems including low solubility and aggregation due to unstructured property. To investigate the structural properties, it is necessary to obtain lots of pure and soluble proteins. Accordingly, the co-expression systems of bacterial chaperone proteins, GroEL-GroES, were used to increase solubility of IMUP-1. From the analysis of NMR and CD experiment data, it is suggested that the protein adopt typical the random coil properties in solution.

• 생명과학회지
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• 제17권1호
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• pp.132-136
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• 2007

E. coli에서 Pseudoalteromonas elyakovii 유래의 alginate lyase유전자(aly)를 발현시킬 때, 대부분의 단백질이 불용성 내포체 형태로 발현됨을 확인하였다. Alginate lyase를 가용성 활성형으로 생산하기 위해 aly와 DnaK/DnaJ/GrpE 또는 aly와 GroEL/ES을 공발현하는 형질전환체를 얻었다. 공발현 결과, 단백질의 올바른 접힘을 도와주는 DnaK/DnaJ/GrpE chaperone이 가용성 및 활성형의 alginate lyase 생산에 매우 효과적임을 알 수 있었다. DnaK/DnaJ/GrpE chaperone의 발현에 유도제인 L-arabinose 최적 농도는 0.05 mg/ml이었으며, 이러한 공발현에 의해 약 34%의 alginate lyase가 가용성 분획에서 생산되었다. 또한 10%의 cetylpyridinium chloride를 첨가함으로써, 공발현 콜로니 주위에 투명환이 형성됨을 확인할 수 있었고, 이는 활성형 alginate lyase 효소에 의해 alginate가 분해되었음을 시사하였다.