• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제23권1호
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• pp.33-40
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• 2010

In this study, the production of transgenic goats using sperm to integrate exogenous DNA and artificial insemination (AI) was carried out and the technical protocols for sperm-mediated gene transfer (SMGT) in the goat were optimized. The standard sperm parameters and the ability to bind foreign genes were assessed to select suitable sperm donor bucks. A total of 134 oestrous does were divided into 4 groups and inseminated using different methods and sperm numbers. The does of Groups I to III were inseminated with fresh semen ($1-2\times10^{7}$ and $10^{6}$ sperm) or frozen-thawed semen ($10^{6}$ sperm), respectively, through conventional intra-cervical AI, and the does of Group IV with frozen-thawed semen ($10^{6}$ sperm) through intrauterine AI. Total genomic DNAs were extracted from ear biopsies of the offspring. The presence of $pEGFP-N_{1}$ DNA was screened by PCR and then by Southern blotting analysis. A total of 76 live kids were produced and 8 kids were tested transgene positive on the basis of agarose gel electrophoresis of the PCR-amplified fragment. Southern blotting analysis of the samples showed 5 positive kids. A transgenic ratio of 10.53% was detected using PCR and 6.58% using Southern blotting. The positive kid rate assayed by PCR and Southern blotting of frozen-thawed goat semen was 3.61% and 9.27% higher than that of untreated semen. The results show that transgenic goats can be produced efficiently by the method of artificial insemination using sperm cells to integrate the exogenous DNA and intrauterine insemination allowed low numbers of DNA-transfected spermatozoa to be used, with satisfactory fertility.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제29권3호
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• pp.201-207
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• 2002

Objective: To observe the capability of fertilization and embryo development including blastocyst formation of the oocytes in simple media after thawing of the cryopreserved cumulus-free mouse oocytes by vitrification method. Methods: Oocytes were collected from 5 to 6 weeks old ICR female mice, and were denuded from the cumulus cells by 0.1% hyaluronidase. Recovered mature oocytes in study group were cryopreserved by vitrification method using EM grid for $5{\sim}7$ days. In brief, oocytes were exposed in dPBS containing 1.5 M EG and 5.5 M EG+1 M sucrose for 2.5 minutes and 20 seconds each, and then executed vitrification by plunging in LN2 after loading on EM grid. Thawing treated by exposure of 1, 0.5, 0.25 and 0.125 M sucrose solution for 2.5 minutes each in order and used for experiments. Spermatozoa aspirated form the epididymis of 12 weeks old ICR male mice were used for insemination after capacitation. T6 media containing 0.4% BSA were used for fertilization and development. Results: Survival and fertilization rates after thawing were 76.9% and 79.6% respectively. Fertilization rate was lower (p<0.005) than that of control group (92.9%). There was no difference in embryo developmental rates from 2-cell to morula, however, the blastocyst formation rate and mean cell numbers of blastocysts in study group (63.3%, $58.9{\pm}9.2$) were lower compared with those of control group (76.1%, $63.5{\pm}8.9$). Conclusion: Vitrification is an effective method for mouse mature oocyte cryopreservation with high survival and fertilization rate after thawing. And in simple media, fertilization rates and embryo development of frozen-thawed mouse oocytes are satisfactory.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제22권4호
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• pp.507-515
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• 2009

A series of experiments were conducted to determine the suitable freezing and thawing temperatures for the freezing of boar semen in 5 ml maxi-straws. The ultrastructure, in vitro fertilization (IVF) and artificial insemination (AI) of frozen-thawed semen were also be evaluated. The 5 cm freezing height gave the best results not only in post-thaw motility rate (54.00%), but also in normal acrosome morphology rate (NAR) (80.23%). There was no significant difference in the post-thaw motility between different thawing temperatures and corresponding thawing times (p>0.05); the group of $52^{\circ}C$ and 25 s gave the highest motility rate (45.00%). As a whole, not only from the motility but also the NAR, thawing at $42^{\circ}C$ was better than the other two treatments. In the freezing packages, 5 ml maxi-straw gave a little lower mobility (40%), viability rate (49.58%), plasma membrane integrity rate (53.91%) and NAR (52.65%) than the 0.25 ml straw, but there was no significant difference between the two straw volumes (p>0.05). The IVF capacity of frozen-thawed semen in this experiment was similar to fresh semen. From ultrastructure observation, the main damage to boar spermatozoa after freezing was seen in the acrosome, such as swelling and formation of vesicles. After AI in recipient Shanghai White sows, frozen-thawed semen from 5 ml maxi-straws and pellets produced 72.2% and 80% conception rate and 7.8 and 8 litter sizes, respectively, and there was no significant difference between the 5 ml maxi-straw and the pellet (p>0.05).

• 한국수정란이식학회지
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• 제27권3호
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• pp.155-162
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• 2012

This study was designed to determine whether low-density lipoporoteins (LDL) extracted from egg yolk in extender improve the function of Korean Jeju Black Bull semen. The semen was cryopreserved with 5% ethylene glycol (EG) or 7% glycerol (G) extenders containing 10% egg yolk (EY), 4% LDL and 5% EY or 8% LDL. Frozen-thawed sperm were evaluated sperm motility, viability, membrane integrity and acrosome integrity. Post-thawed sperm motility has been significantly higher (p<0.05) in 4% LDL + 5% EY ($69.00%{\pm}4.18$; EG and $63.00%{\pm}9.75$; 7% G) than 8% LDL ($57.00%{\pm}5.70$; EG and $52.00%{\pm}4.47$;G). Treatment of 4% LDL + 5% EY-EG ($66.85%{\pm}5.06$) has been significantly improved sperm viability compared to other treatments except 10% EY - EG. Moreover, in membrane integrity, swollen sperm ratio has been only significantly increased (p<0.05) in 4% LDL + 5% EY - EG ($64.65%{\pm}6.10$) among all treatments. In assess to detect acrosome integrity, especially, AR pattern ratio has been significantly decreased (p<0.05) in 4% LDL + 5% EY - EG among all treatments. In sperm viability as time passes, between 4% LDL + 5% EY and 10% EY, there was no significant difference, but 8% LDL was significantly decreased sperm viability in EG (1 and 2 hrs) and G (30 min, 1, 2, 5 and 12 hrs) extender. However, there were no significant differences among all treatments except 8% LDL-G in sperm membrane integrity. 8% LDL-G has been significantly decreased swollen sperm ratio at 5 hrs after thawed. It is concluded from these results that 4% LDL + 5% EY to the freezing extender showed more positive effect on the frozen-thawed spermatozoa in Korean Jeju Black bull.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권3호
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• pp.225-230
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• 2000

본 연구는 소 수정란의 동결에 있어서 완만 및 급속동결과 vitrification동결 후의 생존성을 비교하고 이울러, 내동제의 종류 및 배 발달단계가 vitrification동결 보존 후의 발생율을 조사하고자 수행 하였다. 1. 소 수정란의 vitrification 동결보존 후의 발생율과 부화율은 67.5%와 27.5%로서 급속동결 및 완만동결 운해 후의 발생율과 부화율 42.5% 와 20.0% 및 52.5%와 25.0%에 비해 높게 나타났으나 대조군(82.5%, 37.5%)에 비해서 낮게 나타났다. 2. EFS와 EDS내동제의 처리에 따른 소 수정란의 vitrification 동결보존 후의 발생율과 부화율은 47.5%와 22.5% 및 52.5%와 27.5%로서 대조군의 82.5%와 37.5%에 비해 낮게 나타났다. 3. 소 수정란의 2 cell, 8 cell, morulae, blastocyst stage별 vitrification 동결보존 후의 발생율과 부화율은 25.0%와 15.0%, 32.5%와 20.0%, 37.5%와 20.0%, 52.5%와 27.5% 및 47.5%와 25.0%로서 대조군(82.5%와 37.5%)에 비해 낮게 나타났다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제33권1호
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• pp.23-30
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• 2018

The purpose of this study was to investigate the effects of the concentration of seminal plasma in aerobic and anaerobic conditions on the total motility(TM) and the progressive motility(PM) of spermatozoa in long term preservation of cooled equine semen. We also examine the pregnancy rates after artificial insemination using fresh, cooled or frozen semen, and different durations of cooled-preserved equine semen. In the aerobic state of cooled-preserved semen, As the increase of preserved duration to 24h, 48h, 72h, and 96h, TM tended to decrease in each of different concentrations of formalin-containing experimental group, TM tended to decrease regardless of the concentrations of SP. In different concentrations of SP, TM of without seminal plasma(SP W/O) group tended to be higher than that of SP 20%, SP 33% and SP 50%, especially TM of SP W/O group was significantly higher than other groups at 96 h (p<0.05). PM was higher in the groups of SP W/O and SP 20% than in the groups of SP 33% and SP 50% from 24 h to 72 h in cooled-preservation, especially PM of SP W/O group was significantly higher than other groups at 96 h (p<0.05). In the anaerobic condition of cooled-preserved semen, the results of TM and PM at different concentrations of SP were similar to the results in the aerobic condition although there was a difference in the ratio. The pregnancy rates of fresh-cooled, cooled-preserved and frozen semen were 66.3%, 60.7% and 34.5%, respectively, and the pregnancy rate of frozen semen was the lowest. We also found that it is possible to pregnancy after artificial insemination using 72 h cooled-preserved equine semen. There was similar of the pregnancy rates in the different month from April to August.

• 한국가축번식학회지
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• 제23권3호
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• pp.247-256
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• 1999

본 연구는 한국야생 유래 행동이상 마우스(M. m. molossinus-tt@Kist)의 혈액학 및 혈액생화학치와, 체외수정란과 정자동결보존법, 체외수정과 수정란 이식기법을 이용한 번식장애 개선과 병원성 미생물이 제거된 무병마우스 생산을 위하여 실시하였다. 1. 5주령의 혈액학치에서 RBC, platelet치는 근교계에 비해 높게 나타났다. 혈액생화학치에서는 total cholesterol치가 근교계에 비해 높게 나타났으나 triglyceride, total protein, albumin치는 유사하였다. 2. 과배란 유기시의 평균 채란 수는 PMSG/hCG를 2.5/2.5 lU 투여군에서 11.6개, 5.0/5.0 IU 투여군에서 12.7개로 통계학적 유의 차는 인정되지 않았다. 3. 2.5/2.5 lU 투여군과 5.0/5.0 lU 투여군의 수정율은 각각 87.9%와 52%로 2.5/2.5 lU 부여군이 유의성있게 높은 성적을 나타내었고(p<0.05), 2세포기로의 발달율도 각각 유의성이 인정되는 99.0%와 90.6%였다 (p<0.05). 4. 동결정자를 이용한 체외수정에서의 수정율은 24.8%로 신선정자를 사용했을 때의 87.9% 보다 낮은 성적이었다. 5. 체외 수정란의 이식후의 산자율은 동결 2세포기 체외수정란의 경우 5마리(6.6%), 동결 정사를 이용한 체외 수정란의 경우 6마리(19.4%)와 대조군의 체외수정란의 경우 10마리(21.7%)의 새끼를 얻었다. 6. 이식후 출산한 산자의 미생물학적 검사에서 MHV(Mouse hepatitis virus)와 Staphylo-coccus aureus 등의 병원성 미생물이 무병대리모를 이용한 수정란이식에 의해 제거되었음을 확인하였다.

• 한국수산과학회지
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• 제25권2호
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• pp.79-92
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• 1992

건국대학교 축산대학 부설 양어장에서 사육중인 50마리의 무지개 송어 수컷에서 채취된 정액을 각각 1989년 12월부터 1990년 12월까지 $-20^{\circ}C$와 $-40^{\circ}C$에서 1년 1989년 12월부터 2월까지 2개월동안 $-196^{\circ}C$인 액체질소탱크내에서 그리고 1990년 12월부터 2월까지 $-20^{\circ}C,\;-40^{\circ}C,\;-70^{\circ}C$에서 2개월 동안 동결보존후, $-13^{\circ}C$ 냉수에 해동시켜 20분간 원심분리기에서 정자를 분리시킨 다음 Tyrode 용액으로 50배 정도 희석시킨 후의 정자의 생존율 및 운동성과 신선한 난자와 인공수정시킨 후의 수정률 및 부화율을 조사한 결과는 다음과 같다. 동결보존전과 해동후의 정자의 생존율을 비교해 볼 때 전반적으로 생존전과 큰 차이 없이 생존율이 높게 나타났다. 3가지의 항동해제로 동결보존시킨 후 해동된 정자가 포함된 희석액으로 인공수정시킨 후의 수정률은 모두 $99\%$ 이상으로서 이러한 수치는 $99\%$ 이상을 나타내는 대조구와 차이가 없었고, $-20^{\circ}C,\;-40^{\circ}C,\;-70^{\circ}C$\;-196^{\circ}C와 같이 서로 다른 온도에서도 수정률은 대조구와 큰 차이 없이 나타났다. 1M의 DMSO의 항동해제로 $-196^{\circ}C$에서 2개월 동안 동결보존시킨 후 해동된 정자가 포함된 희석액으로 인공수정시킨지 24일 이후의 수정률 및 부화율은 BSA가 포함된 희석액이 각자 $96\%$ 및 $8\%$ 이고, 포함되지 않은 희석액은 각각 $98\%,\;10\%\;$로서 BSA가 포함되지 않은 경우에서 부화율이 약간 높게 나타났다. 1M DMSO의 항동해제로 2개월동안 동종보존시킨 후 해동된 정자가 포함된 희석액으펄 인공수정 시킨지 24일 이후의 부화율은 각각 $-196^{\circ}C$에서 $10\%,\;-40^{\circ}C$에서 $34\%,\;-70^{\circ}C$에서 $35\%$로 나타났다. 1M의 methanol의 항동해제 동결보존시친 후 해동된 정자가 포함된 희석액으로 인공수정시킨지 24일 이후의 부화율은 각각 $-20^{\circ}C$에서 $22\%,\;-70^{\circ}C$에서 $28\%$로 나타났다. 1M glycerol의 항동해제로 동결보존시킨 후 해동된 정자가 포함된 희석액으로 인공수정시킨지 24일 이후의 부화율은 각각 $-20^{\circ}C$에서 $22\%,\;-70^{\circ}C$에서 $33\%$로 나타났다. 1.5M DMSO의 항동제로 2개월동안 동결보존 시킨 후 해동된 정자가 포함된 희석액으로 인공수정시킨지 24일 이후의 부화율은 각각 $-20^{\circ}C$에서 $27\%,\;-40^{\circ}C$에서 $36\%,\;-70^{\circ}C$에서 $35\%$로 나타났다. 1.5M glycerol의 항동해제로 2개월동안 동결보존시킨 후 해동된 정자가 포함된 희석액으로 인공수정시킨지 24일 이후의 부화율은 각각 $-20^{\circ}C$에서 $34\%,\;-40^{\circ}C$에서 $31\%,\;-70^{\circ}C$에서 $31\%$로 나타났다. 1.5M methane의 항동해제로 2개월동안 동결보존시킨후 해동된 정자가 포함된 희석액으로 인공수정시킨지 24일 이후의 부화율은 각각 $-20^{\circ}C$에서 $28\%-40^{\circ}C$에서 $29\%-70^{\circ}C$에서 $28\%$로 나타났다. 신선한 정자의 중편부는 2본의 중앙섬유소, 9본의 외측조대섬유, 미토콘드리아초로 구성되어 있다. 동결보존시 정자는 편모의 구부러짐, 정자경부의 핵막의 이탈, 핵내용물이 유출되는 손상을 입었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제17권2호
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• pp.137-143
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• 2002

본 연구는 개의 동결정액 제조 시 동결보호 희석액 내에 첨가되는 당의 종류와 조합이 동결융해 후 정자의 생존율 및 운동성에 미치는 영향과 정자동결 시 straw size가 생존율에 미치는 영향에 대하여 조사하고자 실시하였다. 희석액은 Tris-citric acid extender (Tris-buffer)의 기본용액에 20% Egg-yolk, 8% glycerol, 1% Equex STM paste등을 첨가하였으며, 당 성분으로는 monosaccharide(fructose 및 xylose) 및 disaccharide(trehalose)로 구분하여 최종 70 mM의 농도로 첨가 이용하였다. 본 연구에서는 control (fructose, xylose, trehalose), two combination (Fru＋Tre, Fru＋Xy1, Tre＋Xy1) 및 three combination (Fru＋Tre＋Xy1)으로 구분하여 Tris-buffer에 첨가하였다. Fru＋Tre＋Xy1처리구에서 CASA분석 후 운동성이 fructose, trehalose, xylose, Fru＋Tre, Fru＋Xy1, Tre＋Xy1 처리구에 비해 가장 높았다 (69% vs 58, 61, 50, 65, 20, 54%). 또한 전진운동율은 Fru＋Tre 처리구가 fructose, trehalose, xylose, Fru＋Xy1, Tre＋Xy1, Fru＋Tre＋Xy1 처리구에 비해 가장 높았다 (59% vs 47, 55, 42, 13, 49, 44%). 이러한 결과를 바탕으로 Tris-buffer에 F겨＋Tre를 첨가하여 실험을 수행하였다. 예비동결 10분에서 0.25$m\ell$ straw를 이용하였을 때 10분 예비동결에 0.5 $m\ell$, 5분 예비동결에 0.25 및 0.5 $m\ell$ straw 처리구보다 유의적으로 높은 생존율을 얻었다 (80＋0.0 vs. 65＋7, 68＋16, 58＋8%). 본 연구결과 70 mM Fru＋Tre (two combination)가 첨가구가 가장 높은 전진운동율을 얻었으며, 0.25 $m\ell$ straw에 10분간 예비동결을 실시하는 것이 가장 높은 동결융해 후 생존율을 얻을 수 있었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제18권2호
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• pp.91-96
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• 2003

본 연구는 개의 동결정액제조 시 동결보호 희석액 내에 첨가되는 당의 종류와 조합이 동결융해 후 정자 두부의 첨체의 손상과 생존율 및 운동성 등에 미치는 영향에 대하여 조사하고자 실시하였다. 당의 종류에 따른 정자의 첨체손상 정도는 정상 정자비 율은 Fru+Tre, 처리구가 Fructose, Trehalose, Fru+Tre+Xyl, Fru+Xyl, Tre+Xyl, Xylose구에 비해 가장 높았다(83.0$\pm$5.6%, 82.3 $\pm$3.1%, 81.7$\pm$2.1%, 81.0$\pm$5.6%, 80.3$\pm$4.5%, 76.7$\pm$3.8%, 72.0$\pm$2.0%;(P<0.05). Fru+Tre처리구에서 CASA 분석 후 운동성이 Fru +Tre+Xyl, Tre+Xyl, Fru+Xyl, Xylose, Trehalose, Fructose구에 비해 가장 높았다. (79$\pm$6 vs 75$\pm$3, 74$\pm$8, 71$\pm$11, 70$\pm$4, 66$\pm$15, 63$\pm$12%; P< 0.05). 전진운동율은 Fru+Tre 처리구가 Fru+Tre+Xyl, Tre+Xyl, Fru+Xyl, Xylose, Trehalose, Fructose구에 비해 가장 높았다(67$\pm$7, 64$\pm$3, 62$\pm$6, 61$\pm$8, 60$\pm$2, 57$\pm$13, 53$\pm$10%; P<0.05). 본 연구결과 70 mM Fru+Tre (two combination) 가 첨체 손상정도가 낮았으며 가장 높은 운동성 및 전진 운동율의 결과를 얻을 수 있었다.