• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제12권1호
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• pp.77-86
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• 2008

본 연구에서는 LIF의 첨가가 분리된 할구 유래의 생쥐 배아줄기세포 확립에 미치는 영향을 살펴보았다. 과배란 유도된 BDF1 생쥐로부터 2-세포기의 배아를 회수하여 각기 LIF가 첨가되지 않은 배양액과 1,000, 2,500, 5,000 U/mL의 LIF가 첨가된 배양액에서 포배기 배아까지 배양하였다. 배양된 포배기 배아는 차별화 염색 방법을 이용하여 내세포괴와 영양외배엽의 수를 계수하였다. 2,500 U/mL의 LIF 첨가 시 대조군($21.0{\pm}4.0$ vs. $15.9{\pm}5.0$, P<0.01)과 1,000 U/mL의 LIF를 처리한 군($21.0{\pm}4.0$ vs. $16.6{\pm}4.9$, P<0.05)에 비해서 내세포괴의 수가 유의하게(P<0.05) 증가하였다. 배아줄기세포주 확립 배양액으로는 FBS 대신 20% KSR과 0.01 mg/mL의 ACTH를 사용하였다. 2,500 U/mL의 LIF를 첨가 시 배아줄기세포 확립 효율이 36.7%(11/30)로 가장 높은 효율을 나타내었다. 이러한 배양 조건을 기본으로 하여 2-와 4-세포기 배아의 단일 할구를 분리하여 각기 21.4%(3/14)와 4.0%(1/20)의 효율로 단일 할구 배아줄기세포주를 확립할 수 있었다. 단일 할구로부터 확립된 배아줄기세포주와 이들에서 분화된 배아체는 세포면역학적 염색 방법과 RT-PCR 방법을 통해 그들의 미분화 특성과 삼배엽성 분화 특성을 확인할 수 있었다. 결론적으로 배양액에 LIF를 첨가하여 포배기 배아의 내세포괴 수를 증가시킬 수 있었으며, 분리된 할구의 배아줄기세포주 확립 효율을 향상시킬 수 있었다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제11권3호
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• pp.235-243
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• 2007

인간 제대혈 세포는 조혈모세포, 중간엽 줄기세포와내피전구세포를 풍부하게 포함하고 있다. 인간 제대혈 속의 중간엽 줄기세포는 조혈모세포와는 달리 다능성 줄기세포이며 신경세포로 분화할 수 있는 잠재성을 가지고 있다. 본 연구에서는 세포배양을 통해 제대혈의 중간엽 줄기세포를 신경세포와 콜린성 신경세포로 분화를 유도하였다. 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키기 위해 배양액에 dimethyl sulphoxide(DMSO)와 butylated hydroxyanisole(BHA)를 첨가하여 유도하였으며 basic fibroblast growth factor(bFGF), retinoic acid(RA), sonic hedgehog(Shh)를 처리하여 콜린성 신경세포로 분화시켰다. DMSO와 BHA에 처리된 중간엽 줄기세포가 빠르게 신경세포 모양으로 분화하는 것을 관찰하였으며, 이것은 면역조직학적 염색에서 신경세포 특이 표지인 $\beta$-tubulin III, 별아교세포에 대한 특이 표지인 GFAP, 희돌기아교세포에 대한 특이 표지인 Gal-C에 대해 양성반응을 나타내었고, 그 비율은 각각 $32.3{\pm}2.9%$, $11.0{\pm}0.9%,\;9.4{\pm}1.0%$였다. RT-PCR 분석에서 배양 단계에 따라 신경세포에 특이적인 표지 인자가 발현됨을 통해, 중간엽 줄기세포가 신경세포로 분화됨을 확인하였다. 또한, 중간엽 줄기세포에 bFGF, RA, Shh를 처리하여 콜린성 신경세포로 분화시켰을 때, 전체 중간엽 세포 중 $31.3{\pm}3.2%$가 신경세포 특이 표지인 $\beta$-tubulin III에 양성반응을 보였으며 이들 세포 중 $70.0{\pm}7.8%$가 콜린성 신경 특이 표지인 ChAT에 양성반응을 보였고, 이것은 Woodbury 방법에 의한 신경분화의 경우보다 3배 가량 높은 비율로 콜린성 신경의 분화를 유도한 것이다. 이러한 실험 결과들은 인간 제대혈의 중간엽 줄기세포가 콜린성 신경세포로 분화가 가능하고 이러한 잠재성을 가진 제대혈 중간엽 줄기세포는 퇴행성 신경질환에 대한 세포 치료제로서 가능성을 제시한다.

• Journal of Periodontal and Implant Science
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• 제26권2호
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• pp.469-490
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• 1996

The initial events required for periodontal regeneration is the attachment, spreading, and proliferation of appropriated cells at the healing sites. These have been reported that minocycline stimulates the attachment of periodontal ligament cells, and also $TGF-{\beta}1$ enhances the proliferation of periodontal ligament cells. The purpose of the present study was to evaluate the effects of $TGF-{\beta}1$ on the cellular activity of minocycline treated human periodontal ligament cells. Periodontal ligament cells were obtained from the explants of healthy periodontal ligaments of extracted 3rd molars or premolar teeth extracted from the patients for orthodontic treatment. The cells were cultured in minimal essential medium(${\alpha}-MEM$) supplemented with 10.000units/ml penicillin, $10,000{\mu}g/ml$ streptomycin and 10% FBS(fetal bovine serum) at $37^{\circ}C$ in a humidified atmosphere of 5% carbon dioxide and the 5th to the 8th passages of the cells were used. To evaluate the effect of minocycline on cell attachment, the cells were seeded at a cell density of $1.5{\times}10^4$ cells/well in 24-well culture plates and treated with $20{\mu}g/ml$ and $100{\mu}g/ml$ of minocycline for 1.5 h. After trypsinization, the cells were counted with hemocytometer and were taken photographs for observation of cellular morphology. To evaluate the effect of $TGF-{\beta}1$ on minocycline-pretreated periodontal ligament cells, the cells were seeded at a cell density of $1{\times}10^4$ cells/ well in 24-well culture plates and treated with $20{\mu}g/ml$ and $100{\mu}g/ml$ of minocycline for 1.5 h. After incubation, 1 and 10ng/ml of $rh-TGF-{\beta}1$ were also added to the each well and incubated for 1 and 2 days, respectively. Then, MTT assay, DNA synthesis($^3H-thymidine\;assay$), and protein and collagen assay(3H-proline assay) were carried out. In the MIT assay, after 200ul MTT solutionlconeentration of 5mg/ml) were added to the each well of the 24-well plates and incubated for 3 hours, and 200 ul DMSO were added so as to dissolve insoluble blue formazan crystals which was formed in incubated period. Then it read plates on a ELISA reader. For mitogenic assay, 1 uCi/ml $^3H-thymidine$ was added to each well for the final 2 hours of the incubation periods. After labeling, the wells were washed 3 times with ice cold PBS and 4 times with 5% TCA to remove unincorporated label and precipitate the cellular DNA. DNA, with the incorporated $^3H-thymidine$, was solubilized with 500 ul of 0.1% NaOH/0.1% SDS. A 250 ul aliquot was removed from each well and placed in a scintillation vial with 4ml of scintillation cocktail. Using an liguid scintillation counter, counts per minute(CPM) were determined for each samples. 3 uCi/ml $^3H-proline$ was added to each well for the final 4 hours of the incubation periods and total protein and percent collagen synthesis were carried out. The results indicate that minocycline treated group with $100{\mu}g/ml$ concentration for 1.5 hours significantly increased than that of control in cell attachment, and cell process is also evident compared with that of control in cell morphology, and the cellular activity and DNA synthesis rate of cells treated minocycline and $TGF-{\beta}1$ significantly increased than that of control values, but were below to values of the $TGF-{\beta}1$ only treated group in MIT assay and $^3H-thymidine\;assay$, and the total protein synthesis of minocycline and $TGF-{\beta}1$ treated group also significantly increased than that of control values, but the percent collagen synthesis of tested group significantly decreased to compared with control. On the above the findings, the tested group of minocycline and $TGF-{\beta}1$ did not increase the effect on the cell activity than $TGF-{\beta}1$ only tested group and the tested group of minocycline inhibited cell activity. This results indicate that minocycline was effective on cell attachment in early stage, but it is harmful to cell activity, that inhibitory effect of minocycline was compensated with stimulatory effect of $TGF-{\beta}1$.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제27권3호
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• pp.235-243
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• 2000

Objective: Our present studies were conducted to examine more effective isolating method of preantral follicles from mouse ovaries. Methods: ICR mice (3-6 weeks old) were sacrificed through cervical dislocation and their ovaries were removed and put into watch glasses containing Hams F-10 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). Preantral follicles were isolated by three different methods; 1) enzymatical method and 2) mincing method, and 3) scraping method. Enzymatical method was carried out as following. Ovaries were bisected with a pair of fine 30G needles. Bisected ovaries were incubated at $37^{\circ}C$ and 5% $CO_2$ incubator in 2-well dish containing Hams F-10 supplemented with collagenase 600 lU/ml and DNAse 20 lU/ml. After 20 min., follicles were isolated by repeated pipetting. Isolated preantral follicles were collected, and the remnant of tissues was placed in incubator and previous procedure was repeated. Mincing method was carried out with a pair of fine 30G needles attached to 1 ml syringes and minced ovary. Scraping method was carried out with a pair of fine 30G needles and scratched to surface of ovary. The differences between isolating methods were analyzed using Student's t-test and Chi-square. Results were considered statistically significant when ${\rho}$ value was less than 0.05. Results: In handling time, mincing or scraping method ($28{\pm}3.42$ min or $16{\pm}1.58$ min) were significantly (p<0.00001) shorter than enzymatical method ($72{\pm}1.69$ min), and scraping method was significantly (p<0.01) shorter than mincing method. Total number of isolated follicles was significantly (p<0.0001) higher in enzymatical method ($49.8{\pm}3.91$) than in mincing or scraping method ($25.3{\pm}2.33$ or $20.5{\pm}1.75$). Isolated follicles in ${\leq}$90${\mu}m$ were significantly (p<0.005) higher in enzymatical method ($15{\pm}1.71$) than in mincing or scraping method ($7.8{\pm}0.98$ or $8.1{\pm}1.31$). In 91~130 ${\mu}m$, isolated follicles were significantly (p<0.0005) higher in enzymatical method ($33{\pm}3.27$) than in mincing or scraping method ($16.3{\pm}1.82$ or $10.7{\pm}1.38$). In ${\geq}$ 131 ${\mu}m$, isolated follicles were not significantly differences between all groups. In equal sizes, the rate of isolated follicles in ${\leq}$ 90 ${\mu}m$ was highest in scraping method (39.6% vs. enzymatical method: 30.1%, p<0.05; mincing method: 30.9%, p=0.11719, NS). Rate of follicles in $91{\sim}130$ ${\mu}m$ was significantly (p<0.05) lower in scraping method (52.7%) than in enzymatical or mincing method (66.3% or 64.5%). Rate of follicles in ${\geq}$131 ${\mu}m$ was highest in scraping method (8.3% vs. enzymatical or scraping method: 3.6%, p<0.05 or 4.6%, p=0.19053, NS). Conclusions: This study suggests that scraping method is simple and useful for isolation of preantral follicles, because this method reduced handling time and recovered enough follicles. The recovered rate of isolated follicles in diameter of 91 ~ 130 ${\mu}m$ was highest in all methods.

• 고려인삼학회:학술대회논문집
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• 고려인삼학회 2007년도 춘계 학술대회
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• pp.23-24
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• 2007

Purpose: 인삼이 항당뇨 활성을 가진다는 연구가 많은 연구자들에 의해 진행되었고, 이는 인삼의 구성 성분 중 ginsenoside에 기인한다는 보고가 있다. 본 연구는 ginsenoside의 항당뇨 작용기전을 in vitro에서 알아보고자 3T3-L1 지방세포에서 glucose uptake와 췌장 베타세포인 HIT-T15 세포에서 insulin 분비 효과를 확인하였다. 이를 위하여 인삼을 식초로 처리한 긴삼의 70% MeOH 분획으로부터 protopanaxadiol 계인 ginsenoside $Rb_2$, $Rg_3$ 그리고 protopanaxtriol 계인 $Rg_2$를 분리하여 본 실험에 사용하였다. Method: Ginsenoside $Rb_2$, $Rg_2$, $Rg_3$가 지방 세포에서 glucose uptake에 미치는 효과를 확인하기 위하여 3T3-L1 세포를 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 분화 유도시켰으며 3T3-L1 preadipocyte가 80% 정도 자라면 분화 유도 배지 (5% fetal bovine serum (FBS), 0.5 mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 1 mM dexamethasone 그리고 $10{\mu}g/ml$ insulin가 포함된 DMEM)로 4일, $10{\mu}g/ml$ insulin가 포함된 DMEM으로 2일, FBS만 포함된 DMEM으로 2일 배양하여 총 8일 동안 분화를 유도하였다. 분화 유도된 3T3-L1 adipocytes 에 각각 $Rb_2$, $Rg_2$, $Rg_3$를 $20{\mu}M$로 처리하여 16시간 배양하여 low glucose DMEM에서 3시간 배양한 후에 $37^{\circ}C$에서 insulin 10 ng/ml 과 각각 $Rb_2$, $Rg_2$, $Rg_3$가 포함된 Krebs Ringer Hepes buffer(KRP buffer)에서 20분간 배양하였다. 2-deoxy-D-[$^3H$]-glucose를 넣고 10분 후에 차가운 PBS로 반응을 종결시켜 lysis buffer로 cell을 모은 후 scintillation counter를 이용하여 glucose를 측정하였다. Insulin 분비 효과는 HIT-T15 세포와 일차 배양한 흰쥐 소도세포(islets)를 사용하여 확인하였다. HIT-T15 세포는 24 well plate에 well 당 $2{\times}10^5$ 개씩 분주하여 24시간 동안 배양한 후 시료를 처리하였으며 소도 세포는 Sprague-Dawley rat의 췌장에 collagenase가 포함된 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)을 주입하여 분리하고 islets을 얻었다. 분리한 소도세포를 $1{\sim}2$일 동안 배양하여 $Rb_2$, $Rg_2$, $Rg_3$가 각각 $20{\mu}M$의 농도로 첨가된 insulin 측정용 buffer인 Krebs-Ringer buffer (KRB+0.3% BSA, KRBB)에 $37^{\circ}C$에서 1시간 incubation 시킨 후 배양액으로 분비된 인슐린의 양을 측정하였다. 한편 ginsenoside의 인슐린 분비 촉진 기전을 알아보기 위한 실험에서는 ATP-sensitive $K^+$ channel opener인 diazoxide (0.5 mM)가 ginsenoside에 의해 촉진된 인슐린 분비를 억제하는지 살펴보았다. Result: glucose uptake assay 에서는 $Rg_2$가 가장 크게 glucose uptake를 증가시켰고 $Rb_2$, $Rg_3$는 그 활성이 크지 않았다. 한편 Insulin 분비 효과는 diol계인 $Rg_3$에서 용량 의존적으로 인슐린의 분비를 촉진시켰으며 $20{\mu}M$ 농도에서 대조군과 비교해 1.5배 이상의 분비 촉진 효과를 보였고 triol계인 $Rg_2$ 에서는 이러한 효과가 나타나지 않았다. $Rg_3$의 인슐린 분비 촉진 기전을 0.5 mM 의 diazoxide를 이용하여 확인한 결과 $Rg_3$에 의해 촉진된 인슐린 분비를 감소시켰다. 이로 미루어보아 $Rg_3$의 인슐린 분비 촉진 기전은 ATP-sensitive $K^+$ 채널의 봉쇄에 의한 것임을 확인할 수 있었다.

• Restorative Dentistry and Endodontics
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• 제36권1호
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• pp.26-36
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• 2011

연구목적: 본 연구는 in vitro 상에서 치수, 치은, 치주인대 세포를 neuropeptide (substance P, Calcitonin gene related peptides (CGRP))및 inflammatory cytokine (TNF-$\alpha$)으로 자극 시 matrix metalloproteinase (MMPs)의 생성 및 발현을 관찰한 것으로 치아와 치아 주변 조직에 염증이 존재할 경우 neuropeptide 및 inflammatory cytokine과 치아 경조직 혹은 치조골의 remodeling에 중요한 역할을 하는 matrix metalloproteinase (MMPs)와의 관계를 규명하고자 하였다. 연구 재료 및 방법: 시편으로는 우식이 없는 건전한 제3대구치(n = 10)를 사용하였으며, 발거 후 즉시 Phosphate buffered saline (PBS)에 보관하고 치아에서 치은과 치주인대 조직을 채취하였다. 치아를 종축으로 절단하고 치수 조직을 채취하여 조각으로 분리한 후 시편을 PBS에서 세 번 세척하였다. Plate에 치수, 치은, 치주인대 시편 조각을 위치시켜 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)을 첨가하여 세포를 배양하였다. 치수, 치은, 치주인대 세포를 culture dish에서 confluence에 도달할 때 까지 배양하여 Fetal Bovine Serum (FBS)가 포함되지 않은 배지로 교환하여, $37^{\circ}C$에서 24시간 동안 배양한 후 Phosphate buffered saline (PBS)로 1회 세척하고 Substance P ($10^{-8}\;M$, $10^{-5}\;M$)가 포함된 배양액과 Mock (배양액만 포함됨)으로 4시간, 24시간동안 자극하였다. CGRP ($10^{-6}\;M$)을 함유한 배양액 및 TNF-$\alpha$(2 ng/mL)를 포함한 배양액으로 각각 24시간동안 세포를 자극하였다. 각각 다른 농도의 TNF-$\alpha$(2 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL)를 포함한 배양액으로 24시간 동안 세포를 자극 한 후 RNase protection assay 및 Enzyme linked immunosorbent assay를 시행하였다. 결과: SP와 CGRP는 치수, 치은, 치주인대 세포의 MMPs발현에 관여 하지 않았다. TNF-$\alpha$로 24시간 자극 시 치수, 치은, 치주인대 세포에서 MMP-1,-12, -13의 발현을 증가시켰다. 반면, TNF-$\alpha$는 치수, 치은, 치주인대 세포들에서 TIMP-3의 발현을 감소시켰다. 서로 다른 농도의 TNF-$\alpha$(2 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL)로 24시간 자극 시 MMP-1과 MMP-13의 발현이 증가하였다. 결론: 치아와 치아 주변 조직에 염증이 존재 시 TNF-$\alpha$가 증가함에 따라 치수, 치은, 치주인대로부터의 치아의 경조직 혹은 치조골의 remodeling에 관여하는 matrix metalloproteinase (MMPs)가 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.