• 한국발생생물학회:학술대회논문집
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• 한국발생생물학회 2003년도 제3회 국제심포지움 및 학술대회
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• pp.98-98
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• 2003

Recently, human embryonic stem (hES) cells have become very important resources for ES cell basic research, cell replacement therapy, and other medical applications; thus, efficient cryopreservation methods for these cells are needed. This study examined whether a newly developed minimum volume cooling (MVC) vitrification method, which was tested through cryopreservation of sensitive bovine oocytes, can be used for freezing hES cells. Feeder-free cultured hES cell (MB03) colonies were mechanically dissected into several small clumps following enzymatic treatment. We compared the freezing efficiency of a slow-cooling method using a cryo-module (0.4-0.6C/min, 20-30 clumps/vial) and MVC vitrification using a modified 0.5-ml French mini-straw designated as a MVC straw (>$20,000{\circ}C$/min, 10 clumps/straw) After thawing, in vitro survival of hES cell clumps was higher for MVC-vitrified cells (80.8%, 97/120) than for slow-cooled cells (38.2%, 39/102). Further, the proliferation rate of surviving MVC-vitrified cells was similar to that of control hES cells from 2 weeks after thawing. In addition, vitrified-thawed hES cells demonstrated a normal karyotype, were positively immunostained for surface marker antibodies (AP, SSEA-4 and TRA-1-60) and the Oct-4 antibody, and could differentiate into all three embryonic germ layer cells in vitro. This result demonstrates that hES cell clumps can be successfully cryopreserved by a newly developed MVC vitrification method without loss of human cell characteristics.

• 대한소아치과학회지
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• 제28권4호
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• pp.709-727
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• 2001

세포자기사(programmed cell death)는 배자발생과정에서 중요한 역할을 하는 정상적인 생리적현상으로 알려져왔다. 생쥐 배자에서 세포자기사에 관한 많은 연구가 있었지만 초기 형태발생기동안의 전반적이고 구체적인 세포자기사 양상에 관한 보고는 없었다. 이에 본 연구에서는 발생 4.5일$\sim$11.5일째의 Balb/c생쥐배자에서 생쥐발생초기의 세포자기사가 일어나는 양상을 알아보았다. 세포자기사가 일어나는 양상은 배자 조직절편과 온전한 배자에 in situ terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) 반응을 시켜 알아보았다. 주머니포배시기 (발생 4.5일째)에는 세포자기사 과정에 있는 세포가 극히 드물게 속세포명이에서 관찰되었다. Egg cylinder시기 초기(발생 $5.0\sim5.5$일째)에는 소수의 세포자기사 세포가 배자외배엽과 배자내배엽, 원시양막공간에서 나타났다. Egg cylinder시기 후반부(발생 $5.5\sim6.5$일)에는 세포자기사 세포가 배자외배엽, 배자내배엽, 원시양막공간 뿐만 아니라 바깥배자외배엽과 바깥배자내배엽 에서도 관찰되었다. Streak 시기 (발생 $6.75\sim7.75$일)에는 많은 세포자기사 세포가 ectoplacental cone부위에서 관찰된 반면에, 배자바깥 부위에서는 융모막과 바깥배자내배엽에서 매우 적은 수의 세포자기사 세포가 관찰되었고, 배자부위에서는 소수의 세포자기사 세포가 무작위적으로 배자외배엽과 중배엽, 그리고 배자내배엽 부위에서 관찰되었다. 체절형성기 초기 (발생 $8.0\sim8.5$일)에는 많은 수의 세포자기사 세포가 신경주름(neural fold)의 가장 앞쪽(머리쪽)에 주로 분포하는 것이 관찰되었다. 체절형성기 중기(발생 $9.0\sim9.5$일)에 귀기원판(otic placode)부위에서 처음으로 세포자기사 세포가 관찰되었고, 적은 수의 세포자기사 세포들이 또한 눈기원판(optic placode)과 아가미궁에서도 관찰되기 시작하였다. 발생 $9.5\sim9.75$일째에 크게 세가지 흐름의 세포자기사 세포들이 머리쪽 부위에서 관찰되었다. 발생 10.5일째에는 세포자기사 세포들이 발생중인 눈 부위와 안쪽코돌기와 바깥쪽코돌기 그리고 상악돌기가 만나는 부위, 아가미궁의 가쪽부위, 양쪽 하악돌기가 만나는 중앙부위, 그리고 팔다리싹의 꼭대기외배엽능선에 국한되어 관찰되었다. 발생 11.5일째에는 세포자기사 세포가 발생중인 팔다리부위와 꼬리부위를 제외한 나머지 부위에서는 현저히 감소되어 나타났다. 본 연구에서는 생쥐 발생초기 동안에 나타나는 세포자기사 세포가 발생시기에 따라 어느 부위에 발현되는 가는 알아보았는데, 이러한 연구 결과는 배자의 형태발생을 연구하는데 기초적인 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제48권3호
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• pp.222-227
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• 2005

특수미인 거대배아미와 유색미의 발아처리에 의한 항돌연변이 활성의 변화를 평가하고자, 70% 에탄올 추출물이 in vitro에서 산화적 손상에 의한 DNA strand scission을 억제하는 효과와 함께 E. coli 및 V79 배양세포에 화학적으로 유발된 돌연변이에 대한 억제효과를 측정하였다. Mitomycin C로 유발된 돌연변이에 대한 억제활성을 E. coli에서 SOS chromotest로 조사한 결과, 활성은 발아유색미(40.4%) > 발아거대배아미(37.1%) > 무발아유색미(35.5%) > 발아현미(15.7%) > 무발아거대배아미(14.0%) > 무발아현미(0.8%)의 순서였다. Mitomycin C가 유도한 DNA strand scission에 대한 억제 효과는 무발아유색미 > 무발아거대배아미 > 발아유색미 > 발아현미 > 무발아현미 > 발아 거대배아미로 나타났다. V79 세포주에서 4-NQO로 유도된 6-TG 저항성 colony의 형성을 저해하는 활성을 지표로 항돌연변이 활성을 조사한 결과, 발아거대배아미(53.2%) > 무발아유색미(40.0%) > 무발아현미(21.2%) > 발아현미(14.4%) > 무발아거대배아미(0.23%)의 순서로 돌연변이를 저해하였는데, 발아유색미는 돌연변이를 촉진하는 것으로 나타났다(-69%).

• 대한생식의학회:학술대회논문집
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• 대한불임학회 2004년도 제46차 춘계학술대회
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• pp.72-73
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• 2004

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제32권1호
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• pp.126-140
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• 2022

Stem cells can be applied usefully in basic research and clinical field due to their differentiation and self-renewal capacity. The aim of this study was to establish an effective novel therapeutic cellular source and create its molecular expression profile map to elucidate the possible therapeutic mechanism and signaling pathway. We successfully obtained a mesenchymal stem cell population from human embryonic stem cells (hESCs) cultured on chemically defined feeder-free conditions and treated with connective tissue growth factor (CTGF) and performed the expressive proteomic approach to elucidate the molecular basis. We further selected 12 differentially expressed proteins in CTGF-induced hESC-derived mesenchymal stem cells (C-hESC-MSCs), which were found to be involved in the metabolic process, immune response, cell signaling, and cell proliferation, as compared to bone marrow derived-MSCs(BM-MSCs). Moreover, these up-regulated proteins were potentially related to the Wnt/β-catenin pathway. These results suggest that C-hESC-MSCs are a highly proliferative cell population, which can interact with the Wnt/β-catenin signaling pathway; thus, due to the upregulated cell survival ability or downregulated apoptosis effects of C-hESC-MSCs, these can be used as an unlimited cellular source in the cell therapy field for a higher therapeutic potential. Overall, the study provided valuable insights into the molecular functioning of hESC derivatives as a valuable cellular source.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권3호
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• pp.231-235
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• 1989

부착성 동물세포인 recombinant human embryonic kidney cell line 293을 5% FBS가 함유된 DME/F12(3:1) mixture 배지에서 배양할 경우 static culture에서와는 달리 미립담체 배양에서는 낮은 부착효율과 spreading의 저해현상이 관찰되었다. Cell line 293의 미립담체 배양에 있어서 배지내의 serum은 세포의 미립담체에 대한 부착속도(attach-ment rate)를 감소시킬 분만 아니라 세포의 증식을 저해한다는 사실을 확인하였다. 이러한 경우, conditioned microcarrier를 이용함으로써 미립담체로부터 세포의 탈착을 어느 정도 막을 수 있었다. 특히 autocrine growth factor를 생성하는 hepatoma cell line인 HpG 2 cell을 배양하여 얻은 conditioned medium을 serum-free medium에 첨가하여 사용함으로써 세포의 정상적인 성장 분만 아니라 growth-stimulation을 유도할 수 있었다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제32권4호
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• pp.223-227
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• 2008

Human embryonic stem (ES) cells retain the capacity for self-renewal, are pluripotent and differentiate into the three embryonic germ layer cells. The regulatory transcription factors Oct4, Nanog and Sox2 play an important role in maintaining the pluripotency of human ES cells. The aim of this research was to identify unknown genes upregulated in human ES cells along with Oct4, Nanog, and Sox2. This study characterizes an unknown gene, named chromosome 1 open reading frame 31 (C1orf31) mapping to chromosome 1q42.2. The product of C1orf31 is the hypothetical protein LOC388753 having a cytochrome c oxidase subunit VIb (COX6b) motif. In order to compare expression levels of C1orf31 in human ES cells, human embryoid body cells, vascular angiogenic progenitor cells (VAPCs), cord-blood endothelial progenitor cells (CB-EPCs) and somatic cell lines, we performed RT-PCR analysis. Interestingly, C1orf31 was highly expressed in human ES cells, cancer cell lines and SV40-immortalized cells. It has a similar expression pattern to the Oct4 gene in human ES cells and cancer cells. Also, the expression level of C1orf31 was shown to be upregulated in the S phase and early G2 phase of synchronized HeLa cells, leading us to purpose that it may be involved in the S/G2 transition process. For these reasons, we assume that C1orf31 may play a role in on differentiation of human ES cells and carcinogenesis.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제14권2호
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• pp.43-50
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• 2010

최근에 체세포 리프로그래밍 기법을 사용하여 체세포에 몇 가지 전사인자(리프로그래밍 인자)를 넣어줌으로써 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS)를 만드는데 성공하였다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 유사하게 자가재생 할 수 있는 능력이 있으며, 신체의 모든 타입의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가지고 있다. 배아줄기세포와는 달리 면역거부반응이 없다는 점과 윤리적인 문제로부터 자유롭다는 장점이 있어 2006년 Yamanaka 팀이 유도만능줄기세포에 관해 처음 보고한 이후로 이 분야 연구의 급속한 발전이 이루어지고 있다. 하지만 안전성의 문제점 때문에 세포치료제로 사용되기 위해서는 리프로그래밍 인자의 도입 방법 및 새로운 리프로그래밍 인자의 발굴 등 몇 가지 해결해야 할 점들이 남아 있다. 본 종설에서는 유도만능줄기세포를 만드는데 사용된 몇 가지 리프로그래밍 인자에 대해 보고된 연구 내용을 리프로그래밍 인자가 존재하는 세포인 배아줄기세포 및 난자와 배아에서 정리하고자 하며, 리프로그래밍 인자의 연구에 관한 방향에 대해 논의하고자 한다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제22권2호
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• pp.163-170
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• 1995

Growth factors (GFs) produced by the embryo or by the maternal reproductive tract have been reported to regulate the embryonic development and differentiation. Among GFs, EGF as a mitogen plays a role in mitosis and functional differentiation of trophectoderm cells in mouse. The present study was carried out to investigate the effect of EGF on development of mouse embryos and to localize EGF in the mouse oocytes and embryos, which has been reported to be detected in the reproductive tract in mammals. To investigate the effect of EGF on the development of the embryo, mouse 2-cell embryos were cultured to blastocysts stage in Ham's F10 medium, treated with EGF(10-50 ng/ml) for 72 hrs. Immunocytochemistry was performed from oocyte to blastocyst stage with anti-EGF and anti-Mouse IgG, in order to determine the stage which EGF would be expressed in mouse. Exogenous EGF (more than 10 ng/ml) in the culture medium improved the developmental and hatching rates in the mouse embryos. As a result of immunocytochemistry, the embryonic EGF was expressed after the late 4-cell stage. EGF is thought to enhance preimplantation embryonic development and hatching. Exogenous EGF in the culture medium is thought to activate EGF receptor in the late 4-cell embryos and to enhance blastulation and hatching in mouse embryos. It is concluded that EGF enhances the developmental and hatching rates in the mouse embryos.

• 한국수정란이식학회지
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• 제18권3호
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• pp.179-186
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• 2003

Human embryonic stem (hES) cell lines have been derived from human blastocysts and are expected to have far-reaching applications in regenerative medicine. The objective of this study is to improve freezing method with less cryo-injuries and best survival rates in hES cells by comparing various vitrification conditions. For the vitrifications, ES cells are exposed to the 4 different cryoprotectants, ethylene glycol (EG), 1,2-propanediol (PROH), EG with dime-thylsulfoxide (DMSO) and EG with PROH. We compared to types of vehicles, such as open pulled straw (OPS) or electron microscopic cooper grids (EM grids). Thawed hES cells were dipped into sequentially holding media with 0.2 M sucrose for 1 min, 0.1 M sucrose for 5 min and holding media for 5 min twice and plated onto a fresh feeder layer. Survival rates of vitrified hES cells were assessed by counting of undifferentiated colonies. It shows high survival rates of hES cells frozen with EG and DMSO (60.8％), or EG and PROH(65.8％) on EM grids better than those of OPS, compared to those frozen with EG alone (2.4％) or PROH alone (0％) alone. The hES cells vitrified with EM grid showed relatively constant colony forming efficiency and survival rates, compared to those of unverified hES cells. The vitrified hES cells retained the normal morphology, alkaline phosphates activity, and the expression of SSEA-3 and 4. Through RT-PCR analysis showed Oct-4 gene expression was down-regulated and embryonic germ layer markers were up-regulated in the vitrified hES cells during spontaneous differentiation. These results show that vitrification method by using EM grid supplemented with EG and PROH in hES cells may be most efficient at present to minimize cyto-toxicity and cellular damage derived by ice crystal formation and furthermore may be employed for clinical application.