• 한국수정란이식학회지
• /
• 제12권3호
• /
• pp.325-333
• /
• 1997

수정란이식의 주변기술인 초기배의 미세조작및 성 판정은 가축의 경우, 경제 형질의 유전적 개량에 크게 기여하였다. 본 연구는 미세조작 biopsy와 PCR에 의한 체외생산 소 초기배의 급속. 정확한 성 판정 기법을 확립하기 위해 실시하였다. 체외성숙 및 체외수정에 의해 생산된 소수정란은 소 난관상피세포와 공배양을 통해 8-세포부터 배반포시시까지 체외발생시킨 후 미세조작 biopsy에 이용되었다. 미세조작 biopsy 과정중에 약간의 형태적인 손상이 관찰되었지만 대부분의 demi-embryo는 정상적인 배반포와 나화배반포로 발생하였다. 8~16 세포, 상실배, 초기배반, 포 시기에서 미세조작 biopsy 후 확장 또는 나환배반포기시기까지의 발달율은 각각 62.8(27/43), 83.3(30/36) 및 80.9%(55/68)로 정상적인 초기배와 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 총 136개의 소 초기배로 부터 2~10개의 할구세포를 미세조작 biopsy에 의해 분리하여 소 특이와 Y-특이염기서열을 가진 두 쌍의 염기서열을 이용하여 PCR을 수해하였다. 이들중 112(82.4%)개를 성공적으로 성 판정하였으며, 암/수 비율은 각각 34.8(39/112)/65.2%(73/112)로 나타났다. 본 실험에서 얻은 결과는 확립된 소 초기배의 미세조작기술과 성 판정 방법을 통해 계획적인 암.수 송아지의 선별 생산뿐만 아니라 소 수정란 이식을 통한 유전적 개량을 촉진시키는데 효과적으로 이용될 수 있는 기술이 확립된 것을 보여주었다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제15권3호
• /
• pp.219-230
• /
• 2000

This study was carried out to determine the factors on achieving good viability of embryos biopsied fur sexing, to investigate pregnancy rate following embryo transfer(ET) with sexed embryos, and to confirm the accuracy for the calves bort following ET with sexed embryos by polymerase chain reaction(PCR). To investigate viability of Hanwoo embryos after biopsy for sexing, fresh and frozen/thawed embryos were biopsied according to different developmental day of blastocysts, different stage of blastocysts, and different biopsy grade and the embryos themselves were incubated for 2 hours in TCM199 after microsection to be evaluated morphologically for recovery as blastocyst. The results obtained were as follows : 1. The rate of oocytes cleaved in vitro and the rate of blastocyst of the cleaved oocytes were 52.5% and 21.6%, respectively. The rate of blastocyst on day 8 was 11.2%, denoting the highest rate during whole culture period posterior to in vitro fertilization(IVF) 2. After biopsy for sexing, the viability rate of blastocyst on day 7, 8 and 9 was 75.0%, 88.4%, and 100.0%, respectively and the viability of early, mid, and expanded blastocyst after biopsy was 75.0%, 88.9%, and 91.1%, respectively The viability rate of fresh and frozen/thawed embryos was 89.9%, 71.4%, respectively. And the viability of expanded, hatching, and hatched blastocyst of frozen/thawed embryos was : 75.0%, 75.0%, and 50.0%, respectively. The viability of embryos according to biopsy grade of 10∼20%, 21∼30%, and 31∼40% was 85.7%, 91.5%, and 71.4%, respectively. 3. Pregnancy rate after transfer with biopsied embryo between flesh and frozen/thawed embryos was 22.6% and 20.0%, respectively. 4. In comparison between sex by PCR method and sex of calves born after embryo transfer, the accuracy of sex deterimination was 92.3% (12/13).

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제20권2호
• /
• pp.169-176
• /
• 2005

수정란의 성 판별은 유전적으로 우수한 유전형질을 보유하고 있는 소의 수정란을 성 판별하므로서 희망하는 성의 송아지를 생산할 수 있으며, 부가가치가 높은 수정란을 확보할 수 있는 기술이다. 수정란의 손상을 최소화하면서 할구를 biopsy하는 기술을 개발하고, 간단하고 빠른 시간에 성 판별이 가능한 Loop-mediated isothermal amplification방법으로 수정란을 성 판별을 실시한 결과는 다음과 같다. 1. 한우 체내 수정란의 성비는 암컷이 $56.5\%$, 수컷이 $43.5\%$였고, 체외 수정란은 암컷이 $49.2\%$, 수컷이 $33.9\%$였다. 그리고, 젖소 체외 수정란의 성비는 암컷이 $29.2\%$, 수컷이 $70.8\%$를 나타내어 한우 체내 및 체외 수정란보다 젖소 체외수정란의 수컷비율이 유의적으로 높게 나타내었다(p<0.05). 또한, 한우 체외 수정란에서 성 판별이 불가능한 것이 $16.9\%$를 나타내어 한우 체내 수정란 및 젖소 체외 수정란과는 유의적인 차이를 나타내었다.(P<0.05). 2. Biopsy한 체내 수정란의 체외 발달율은 $100\%$였으나 체외 수정란에서는 정상적으로 발달하지 못하고 퇴화된 수정란이 $13.2\%$로 체내 수정란보다 유의적으로 높은 결과를 나타내었다.(P<0.05). 3. Punching 방법으로 수정란의 biopsy 후 정상적으로 발달하지 못하고 퇴화된 수정란은 체내 및 체외 수정란에서는 없었으나 biopsy 방법으로 biopsy한 수정란은 체내 및 체외 수정란에서 각각 $16.7\%$ 및 $22.6\%$를 나타내어 Punching 방법보다 유의적으로 높은 결과를 나타내었다(P<0.05). 이상의 결과로 보아 한우 체내 수정란은 LAMP방법을 이용하여 간단하고 신속하게 성 판별이 가능하며, 수정란의 biopsy는 punching 방법이 수정란에 손상을 적게 주는 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
• /
• 한국수정란이식학회 2004년도 제4회 발생공학 국제심포지움 및 학술대회
• /
• pp.105-105
• /
• 2004

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제15권2호
• /
• pp.175-180
• /
• 2000

The possible use of micromanipulative biopsy and PCR of the biopsied embryonic cells was tested to produce sexed bovine embryos in practical terms. By micromanipulation and PCR techniques, higher survival rate and accurate sexing of demi-embryos were btained. Bovine oocytes matured and fertilized in vitro were co-cultured with bovine oviductal epithelial cell (BOEC) monolayer in USU-6 medium supplemented with 15% FBS, and the embryos of 37% (327/885) were developed to blastocysts. Among 111 blastocysts produced by invitro, only 7 (6.3%) embryos were found unable to determine their sex, probably due to the loss of cells, since no PCR product was found from those cells. All the remaining 104 (93.7%) demi-embryos survived micromanipulation and demonstrated male-specific product or bovine-specific product alone suggesting that correct sexing of the sample. Forty-three point one percent(25/58) of manipulated and cryopreserved demi-embryos after thawing were survived. Final verification of the sexed embryos is necessary to make sure the same sex in fetus and newborn calf upon embryo transfer. The established sexing method on a large number of bovine embryos from previous and this study suggests that this a could be used practically in the field.

• Reproductive and Developmental Biology
• /
• 제36권4호
• /
• pp.269-273
• /
• 2012

The present study was to assess the in vitro viability and sexing rate of bovine embryos. Blastocysts were harvested on day 7~9 day after insemination(in vitro and in vivo), and the sex of the embryos was examined using the LAMP method. Embryo cell biopsy was carried out in a $80{\mu}l$ drop $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$ free D-PBS and, biopsied embryos viability were evaluated after more 12 h culture in IVMD culture medium. The formation of recovered embryo to expanded and hatching stages had ensued in higher of sexed embryo in vivo than in vitro (100% vs. 89%, p<0.05), and in vitro, the rates of degeneration after sexing were significantly (p<0.05) higher in vitro than in vivo(11% vs. 0.0%). The rates of the predicted sex were female 61% vs. 56%, and male 39% vs. 44% in vivo and in vitro, respectively. The rates of survival following different biopsy methods were seen between punching and bisection method in vivo and in vitro (100% vs. 89% and 100% vs, 78% respectively). Biopsy method by punching was significantly (p<0.05) higher than bisection between produced embryos in vivo and in vitro. The present data indicate that with microblade after punching for embryo sexing results in high incidence of survivability on development after embryo biopsy. It is also suggested that LAMP-based embryo sexing suitable for field applications.

• Journal of Animal Science and Technology
• /
• 제49권2호
• /
• pp.287-294
• /
• 2007

성판별을 위한 biopsy 후 수정란의 발달율 및 동결－융해 후의 생존율 조사는 다음과 같다. 한우 체내 및 체외 수정란의 성판별을 위해서 영양막 세포의 일부를 채취하기 위해서 수정란을 biopsy 하였다. biopsy된 수정란의 생존율 조사의 결과는 체내 수정란이 100% 그리고 체외수정란이 90.0%의 결과를 나타내어 체내 수정란이 체외 수정란 보다 biopsy 후의 생존율이 높게 나타났음을 알 수 있었다. 수정란의 성판별 비율은 체내 수정란에서는 암컷과 수컷의 비율이 46.3%와 53.7%로 각각 나타나 수컷의 비율이 암컷 보다 다소 높은 경향을 보였으며, 체외 수정란에 있어서는 암컷과 수컷의 비율은 40.0% 와 60.0%로 수컷의 비율이 높게 나타났으나 유의적인 차이는 보이지 않았다. 성판별된 수정란의 동결－융해 후 생존성은 완만동결 방법에 의한 수정란의 생존율은 체내 수정란에서 58.8 %, 체외 수정란에서는 41.7% 그리고 초자화동결 방법에서는 체내 수정란의 생존율이 77.8%, 체외 수정란은 57.1%로의 결과를 보여 체내 수정란을 이용한 초자화동결 방법에서 상대적으로 더 높은 생존율을 보였다.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
• /
• 한국수정란이식학회 2007년도 춘계학술세미나 및 워크숍
• /
• pp.51-62
• /
• 2007

성판별을 위한 biopsy 후 수정란의 발달율 및 동결-융해 후의 생존율 조사는 다음과 같다. 한우 체내 및 체외 수정란의 성판별을 위해서 영양막 세포의 일부를 채취하기 위해서 수정란을 biopsy 하였다. biopsy된 수정란의 생존율 조사의 결과는 체내 수정란이 100% 그리고 체외수정란이 90.0%의 결과를 나타내어 체내수정란이 체외수정란보다 biopsy 후의 생존율이 높게 나타났음을 알 수 있었다. 수정란의 성판별 비율은 체내수정란에서는 암컷과 수컷의 비율이 46.3%와 53.7%로 각각 나타나 수컷의 비율이 암컷보다 다소 높은 경향을 보였으며, 체외수정란에 있어서는 암컷과 수컷의 비율은 40.0%와 60.0%로 수컷의 비율이 높게 나타났으나, 유의적인 차이는 보이지 않았다. 성 판별된 수정란의 동결-융해 후 생존성은 완만동결 방법에 의한 수정란의 생존율은 체내수정란에서 58.8%, 체외수정란에서는 41.7% 그리고 초자화 동결 방법에서는 체내수정란의 생존율이 77.8%, 체외수정란은 57.1%로의 결과를 보여 체내수정란을 이용한 초자화 동결 방법에서 상대적으로 더 높은 생존율을 보였다.

• 한국동물생명공학회지
• /
• 제37권4호
• /
• pp.292-297
• /
• 2022

Direct injection of CRISPR/Cas9 into zygotes enables the production of genetically modified nonhuman primates (NHPs) essential for modeling specific human diseases, such as Usher syndrome, and for developing novel therapeutic strategies. Usher syndrome is a rare genetic disease that causes loss of hearing, retinal degeneration, and problems with balance, and is attributed to a mutation in MYO7A, a gene that encodes an uncommon myosin motor protein expressed in the inner ear and retinal photoreceptors. To produce an Usher syndrome type 1B (USH1B) rhesus macaque model, we disrupted the MYO7A gene in developing zygotes. Identification of appropriately edited MYO7A embryos for knockout embryo transfer requires sequence analysis of material recovered from a trophectoderm (TE) cell biopsy. However, the TE biopsy procedure is labor intensive and could adversely impact embryo development. Recent studies have reported using cell-free DNA (cfDNA) from embryo culture media to detect aneuploid embryos in human in vitro fertilization (IVF) clinics. The cfDNA is released from the embryo during cell division or cell death, suggesting that cfDNA may be a viable resource for sequence analysis. Moreover, cfDNA collection is not invasive to the embryo and does not require special tools or expertise. We hypothesized that selection of appropriate edited embryos could be performed by analyzing cfDNA for MYO7A editing in embryo culture medium, and that this method would be advantageous for the subsequent generation of genetically modified NHPs. The purpose of this experiment is to determine whether cfDNA can be used to identify the target gene mutation of CRISPR/Cas9 injected embryos. In this study, we were able to obtain and utilize cfDNA to confirm the mutagenesis of MYO7A, but the method will require further optimization to obtain better accuracy before it can replace the TE biopsy approach.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제20권2호
• /
• pp.163-168
• /
• 2005

혈통이 등록된 우수한 한우 공란우로부터 회수한 수정란을 간편한 방법으로 성 판별하여 우수한 암송아지를 생산하고자 실시한 결과는 다음과 같다. 회수한 수정란을 punching 또는 bisection 방법으로 biopsy하여 Loop-mediated isothermal amplification법으로 성 판별하였으며, 암컷으로 예측되는 성 판별 수정란을 6두의 수란우에 이식하여 2두가 임신되었고, 수정란 이식 후 278일과 285일에 정상적인 암컷 송아지를 각각 분만하였다. 분만된 송아지 바란이와 보란이의 생시체중은 각각 18kg 및 25kg이었으며, 90일령 보정체중은 각각 61.1kg 및 88.8kg으로 일당증체량은 0.48kg 및 0.71kg이었다.